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11.体外培养的细胞按生长方式可分为哪二种?按细胞在体外生长的形态特征,可分为哪几种常见类型?⑴按生长方式分为二型：粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。（绝大多数有机体细胞属粘附型细胞。）⑵可分四型：(1)上皮型细胞(2)成纤维型细胞(3)游走型细胞(4)多形型细胞2.简述体外培养细胞的整个生命活动过程的分期及每代贴附生长细胞的生长过程⑴通常，体外培养细胞的全部生命期大致可被分为以下三个阶段：①原代培养期：也称初代培养，是指从机体中取出细胞接种培养到第一次传代之前的这一阶段。此期的细胞呈现出活跃移动的特点，可见细胞分裂，但不旺盛。处于原代培养阶段的细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上有很大的相似性。细胞群具有明显的异质性，细胞间的相互依存性强，在软琼脂培养基培养时细胞集落形成率很低。②．传代期：通常是培养细胞全生命期中持续时间最长的时期，原代培养的细胞经传代后常被称做细胞系。一般情况下，正常体细胞在传代10-50次左右后，细胞分裂的能力就会逐渐减弱，甚至完全丧失，细胞便进入衰退期。③衰退期：处于衰退期的培养细胞，增殖速率已经变得很慢或不再增殖，直至最后衰退死亡。以上特点，主要是针对体外培养的机体正常细胞，对于体外发生转化的细胞和肿瘤细胞而言，永生性或恶型性的获得使得这类细胞获得持久性的增殖能力，这样的细胞群体常被称为无限细胞系或连续细胞系。⑵每代贴附生长细胞的生长过程：①游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮状态，也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。时间：10分钟一4小时②贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。底物：玻璃、塑料、胶原、其它细胞等③潜伏期：此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。④对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。⑤停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂机制：接触抑制、密度限制23.简述体外培养细胞对生存环境的基本要求.⑴细胞的营养需要：①基本营养物质：氨基酸（１２种＋谷氨酰胺）、维生素、葡萄糖、核糖、脱氧核糖等无机离子。②促细胞生长因子：多由血清提供⑵细胞的生存环境：①温度条件对细胞生长的影响：不同生物来源的组织细胞培养温度不同；体外培养动物细胞最常用的温度是37℃，耐低温不耐高温。在生理温度范围内，温度与细胞生长率之间存在正相关关系。②气相环境对细胞生长的影响：动物细胞培养的气相环境都是采用5%CO2与95%空气（提供氧）的混合气体。Ｏ2参与细胞的能量代谢过程，ＣＯ2用于维持培养液的酸碱度，一般多为开放式培养③培养液的酸碱度对细胞生长的影响：大多数的有机体细胞能在pH6.0～8.0的环境中生存。最适宜的pH值范围是7.2～7.4。体外培养的正常细胞耐酸能力要强于耐碱能力④无污染、无毒。4．什么是细胞培养用液,主要分为哪几类?⑴培养用液是维护组织细胞生存、生长及进行细胞培养各项操作过程中所需的基本溶液。⑵主要包括：平衡盐溶液；培养基；其他培养用液。5．D-Hank’s与Hank’s的主要区别是什么?D-Hank’s不含有Ca2+、Mg2+，常用于配制胰酶溶液。6．简述胰酶的常用浓度及配制时的注意事项。胰酶(trypsin)溶液：浓度一般为0.1％～0.25％，配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液。7.细胞培养中血清的主要作用？(1)提供基本营养物质；(2)提供贴壁和扩展因子(3)提供激素及各种生长因子；(4)提供结合蛋白(5)对培养中的细胞提供某些保护作用38.血清的使用与储存有哪些注意事项？（1）使用前的处理：使用前通常在56℃加热30分钟，这一过程称为灭活。热灭活目的：灭活血清中的补体成分。对于一些品质高的胎牛血清和新生牛血清可以考虑不经灭活直接用于细胞培养。（2）储存条件：血清一般储存于－20℃,同时应避免反复冻融。大包装的血清，首先将血清灭活处理，然后分装为小包装，如10ml、20ml、50ml，储存于-20℃，使用前融化。融化后的血清在4℃不宜长时间存放，应尽快使用。9.简述干粉培养基的配制过程。DMEM培养液的配制（举例）：⑴900mLddH2O于1000mL烧杯中，将DMEM粉1包倒入其中，盛粉袋用50mLddH2O分次冲洗，也倒入容器，磁力（或玻棒）搅拌溶解。⑵用5％－10％的NaHCO3调pH至7.2。⑶加青、链霉素至终浓度100u/mL和100ug/mL⑷用0.22um的滤膜过滤除菌。⑸分装（200mL左右）后4℃冰箱保存。10.细胞培养工作室可分为那几个部分，各有什么作用?一般包括：准备室、培养室和缓冲室。作用：⑴准备室：用于进行培养器皿的清洗、包装、培养物质的准备和消毒以及供应物品的保藏等。⑵培养室：用于进行细胞培养和各种无菌操作的实验室。其基本条件是：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。天花板不宜高过2.5M。⑶缓冲室：（更衣室）11.CO2培养箱的作用及使用中的注意事项。用于维持适当温度、湿度与pH。注意事项：⑴质量关键在控温装置，温度变化一般不应超过0.5度;培养箱的温度设在35～37℃，这是人和哺乳动物培养细胞的最适温度。⑵培养容器需与外界保持通气状态。⑶箱内空气应保持干净，定期消毒（紫外灯、酒精）⑷水槽:保持一定湿度12.试述清洁液的配方组成及配制时的注意事项。⑴清洁液:重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml），强清洁液63∶1000∶200，次强清洗液120∶200∶1000，弱清洁液100∶100∶1000⑵配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸，并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色413．简述消毒灭菌的常用方法、要求条件及主要应用范围。⑴物理消毒灭菌法①紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿。消毒时间：30min（至少）；紫外杀菌功能除了紫外本身以外，还可以由产生的臭氧来完成。紫外灭菌以后，最好过一个小时再进去。②过滤：0.22μm（适用于液体）③湿热（高压蒸气灭菌法）15磅,121℃，20min各种物品有效消毒压力和时间不同，一般要求如下：培养用液、橡胶制品l0磅l0分钟布类、玻璃制品、金属器械等15磅20分钟④干烤：160℃,2小时（适用于玻璃器皿等）注意：消毒后不要立即打开箱门，以防冷空气骤然进入引起玻璃炸裂，影响消毒效果。⑵化学消毒灭菌法：①7５%酒精主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理。②1－２‰新洁尔灭主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。③抗生素主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。细胞培养中最常用的抗生素是青霉素（常用浓度是100u/ml）与链霉素（100μg/ml）。不要在原代培养中加入抗生素。14.如何对玻璃器皿进行有效清洗？玻璃器皿的清洗：浸泡—刷洗(+烘干)—浸酸—冲洗；清洗后的玻璃器皿：干净透明无油迹。⑴浸泡：①初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉。②新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等。先用自来水简单刷洗，然后用5％稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。③再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的残留蛋白质，干固后不易洗掉，用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。⑵刷洗：用毛刷（特制的羊毛刷）沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质。刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。自然晾干或烘干后泡酸。⑶浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液（洗液）中。清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质。浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面。浸泡时间：一般为过夜，不应少于6小时。⑷冲洗：在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗,使之尽量不留污染或清洁液的残5迹。最好用洗涤装置。如用手工操作，需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，然后用蒸馏水清洗3-5次，晾干（或烘干）备用15．细胞培养中最常用的抗生素及使用浓度是什么?青霉素（常用浓度是100u/ml）与链霉素（100μg/ml）。16．什么是原代培养？简述原代培养方法的分类及主要操作步骤。⑴原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称原代培养。⑵原代培养方法分类：贴块法和消化法。消化法又分为冷消化与热消化；一次性消化与分次消化。主要步骤：贴块法：将取得洗净并剔去多余成分的组织切成约1mm3大小的植块，用于植块培养。消化法：将取得洗净并剔去多余成分的组织剪碎——蛋白酶溶液消化——机械方吹打组织块—对滤过液离心（1000r/min,10min）——用培养液悬浮成细胞悬液——计数并调节细胞密度——用于分离细胞培养17．何谓传代培养？简述贴壁细胞的传代操作步骤。⑴传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到另一培养瓶的培养。⑵贴壁细胞传代培养：①选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯旁，倒去瓶中的旧培养液，加入2～3ml的D-Hanks液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片。②加入适量0.１％－0.25％胰蛋白酶消化液，室温消化，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。③用Hanks液洗涤1次，加入适量培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。④以1：2或1：3进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37℃CO2培养箱培养。⑤观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。18．收集细胞时一般常用的转速和时间是多少？转速：1000r/min；时间：5min19.什么是冷冻保存？影响细胞冷冻保存效果的因素有哪些？⑴冷冻保存(cryopreservation)：将体外培养物悬浮在加有冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度(一般是低于-70℃的超低温条件)，并在此温度下对其长期保存的过程。6⑵①冷冻速率当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较大冰晶,造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。②冷冻保存温度：液氮温度(-196℃)是目前最佳冷冻保存温度。应用-70℃～-80℃条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显下降。③复温速率指在细胞复苏时温度升高的速度。一般来说复温速度越快越好。常规的做法是，在37℃水浴中，于1～2min内完成复温。在冷冻复苏中遵循：慢冻速溶原则。④冷冻保护剂：是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质。分为：渗透性：常用甘油、DMSO非渗透性甘油或二甲基亚砜这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。保护机制：是在细胞冷冻悬液完全凝固之前，渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤；同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。甘油和DMSO并不能防止细胞内结冰。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷，让甘油或DMSO等充分渗到细胞内，在细胞内外达到平衡以起到充分的保护作用。目前，DMSO的应用比甘油更为广泛。非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质。20．冻存的细胞一般如何复苏？1)将恒温水浴箱的温度调至37～40℃。2)从液氮中取出冻存小管，立即投入37～40℃温水中快速晃动，直至冻存液完全融解。要在1～2min内完成复温。3)将细胞冻存悬液移入离心管，加入约5m1培养液，轻轻吹匀。4)将细胞悬液经800～1000r/min离心5min。弃上清液。5)给细胞沉淀物加入完