第三章--液质联用原理及应用-2013

1色谱-质谱联用的原理及应用2学习目的掌握质谱的基本组成、工作原理掌握常用的质谱术语、常用离子源工作原理掌握液质联用的定性、定量方法熟悉液质联用条件优化了解液质联用的应用3质谱原理简介质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所作的条状图就是我们常见的质谱图。4简介色谱质谱的在线联用将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便。色谱质谱联用包括气相色谱质谱联用(GC-MS)和液相色谱质谱联用(LC-MS)，液质联用与气质联用互为补充，分析不同性质的化合物。5液质联用与气质联用的区别:气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可与标准谱库对比。液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。6Neutral101102103104105MolecularWeightIonicAnalytePolarityIonSprayAPCIGC/MS7现代有机和生物质谱进展初期：质谱法通常只能测定分子量500Da以下的小分子化合物。20世纪70年代：场解吸（FD）离子化技术，能够测定分子量高达1500~2000Da的非挥发性化合物，但重复性差。20世纪80年代：快原子质谱法（FAB-MS），能够分析分子量达数千的多肽。电喷雾离子化质谱法（ESI-MS）和基质辅助激光解吸离子化质谱法（MALDI-MS）蛋白-生命科学8常见术语9910常见术语质荷比:离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电荷(以电子电量为单位计)的比值,写作m/Z.峰:质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰.离子丰度:检测器检测到的离子信号强度.基峰:在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰.总离子流图；质量色谱图；准分子离子；碎片离子；多电荷离子；同位素离子11总离子流图在选定的质量范围内，所有离子强度的总和对时间或扫描次数所作的图,也称TIC图.12质量色谱图指定某一质量(或质荷比)的离子其强度对时间所作的图。利用质量色谱图来确定特征离子，在复杂混合物分析及痕量分析时是LC/MS测定中最有用的方式。当样品浓度很低时LC/MS的TIC上往往看不到峰，此时，根据得到的分子量信息，输入M+1或M+23等数值，观察提取离子的质量色谱图，检验直接进样得到的信息是否在LC/MS上都能反映出来，确定LC条件是否合适，以后进行MRM等其他扫描方式的测定时可作为参考。131.02.03.04.001020304050607080901001.02.03.04.05.06.00102030405060708090100质量色谱图总离子流图14准分子离子指与分子存在简单关系的离子，通过它可以确定分子量。液质中最常见的准分子离子峰是[M+H]+或[M-H]-。在ESI中,往往生成质量大于分子量的离子如M+1，M+23，M+39，M+18......称准分子离子，表示为:[M+H]+，[M+Na]+等15碎片离子准分子离子经过一级或多级裂解生成的产物离子。碎片峰的数目及其丰度则与分子结构有关，数目多表示该分子较容易断裂，丰度高的碎片峰表示该离子较稳定，也表示分子比较容易断裂生成该离子。16HNCH3OHCH3Ephedrine,MW=1651717多电荷离子指带有2个或更多电荷的离子，常见于蛋白质或多肽等离子。有机质谱中，单电荷离子是绝大多数，只有那些不容易碎裂的基团或分子结构-如共轭体系结构-才会形成多电荷离子。它的存在说明样品是较稳定的。采用电喷雾的离子化技术，可产生带很多电荷的离子，最后经计算机自动换算成单质/荷比离子。18同位素离子由元素的重同位素构成的离子称为同位素离子。各种元素的同位素,基本上按照其在自然界的丰度比出现在质谱中,这对于利用质谱确定化合物及碎片的元素组成有很大方便,还可利用稳定同位素合成标记化合物,如:氘等标记化合物,再用质谱法检出这些化合物,在质谱图外貌上无变化,只是质量数的位移,从而说明化合物结构,反应历程等。19有机质谱OrganicMassSpectroscopy优点：1.灵敏度高2.测定分子量，确定分子式3.分析范围广（气体、液体、固体）4.各种联用技术5.新的电离、检测技术20真空系统VacuumSystem进样系统SampleInlet检测器Detector数据处理系统DataSystem质量分析器MassAnalyser离子源IonizationSource一、质谱仪的组成ComponentsofanyMassSpectrometer2121进样系统离子源质量分析器检测器22真空系统质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在高真空状态下工作，以减少本底的干扰，避免发生不必要的离子-分子反应。所以质谱反应属于单分子分解反应。利用这个特点，我们用液质联用的软电离方式可以得到化合物的准分子离子，从而得到分子量。由机械真空泵(前极低真空泵)，扩散泵或分子泵(高真空泵)组成真空机组，抽取离子源和分析器部分的真空。只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器，真空度不够则灵敏度低。23进样系统把分析样品导入离子源的装置，包括：直接进样，GC，LC及接口，加热进样，参考物进样等。24离子源GC-MS的EI和CI源，离子化方式有大气压电离（API）（包括大气压电喷雾电离ESI、大气压化学电离APCI、大气压光电离APPI）与基质辅助激光解吸电离。API采用四极杆或离子阱质量分析器，统称API-MS。MALDI常用飞行时间作为质量分析器，所构成的仪器称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）。2525质量分析器磁质量分析器（MagneticSectorAnalyzer）飞行时间质谱计（timeofflight,TOF）四极质量分析器（quadrupolemassanalyzer）离子阱（iontrap）傅立叶变换离子回旋共振质谱计（Fouriertransformioncyclotronresonance,FT-ICR）26检测接收器接收离子束流的装置，有：电子倍增器、光电倍增器、微通道板27数据及供电系统将接收来的电信号放大、处理并给出分析结果及控制质谱仪个部分工作。从几伏低压到几千伏高压。281.质量范围（massrange）质谱仪所能测定的离子质荷比的范围。四极质谱：1000以内离子阱质谱：~6000飞行时间质谱：无上限二、质谱仪的主要性能指标29292.分辨率（resolution）分辨率R是指质荷比相邻的两质谱峰的分辨能力。若近似等强度的质量分别为M1及M2的两个相邻峰正好分开，则质谱仪的分辨率定义为：R=;式中M=;M=M2-M1MMM1+M223030国际上：1）R10%：两峰间的峰谷高度为峰高的10%时的测定值；2）一般难以找到两个质量峰等高，且重叠的谷高正好等于峰高的10%，则定义：R=;式中a为其中一峰的峰高5%处的峰宽;b为相邻两峰的中心距离MMba3131低分辨率质谱仪：R1000高分辨率质谱仪：R≧10000（FT-ICRMS：R可达1106）利用高分辨率质谱仪可测定精确的质量数（分子式）！质荷比均为28的分子：CO:27.9949N2:28.0062C2H4:28.031332323.灵敏度（sensitivity）对于一定样品（如硬脂酸甲酯），在一定的分辨率情况下，产生一定信噪比（如S/N501）的分子离子峰所需的样品量。3333质谱图横坐标：质荷比(m/z)纵坐标：相对丰度(最强峰的强度定为100%)1008060402020CCH3O7710577105CO120(M+·)5143406080100120m/z相对丰度/(%)苯乙酮的质谱图3434三、离子源（IonizationSource）电子轰击电离（electronimpactionization,EI）化学电离（chemicalionization,CI）场电离（fieldionization,FI）场解吸（fielddesorption,FD）快原子轰击（fastatombombardment,FAB）基质辅助激光解吸电离（matrix-assistedlaserdesportionionization,MALDI）电喷雾电离（electrosprayionization,ESI）大气压化学电离（atmosphericpressurechemicalionization,APCI）3535质谱中最常用的离子源，一般为70eV的电子束，远大于大多数有机化合物的电离电位（7~15eV），会使相当多的分子离子进一步裂解，产生广义的碎片离子。SoftIonizationEventHardIonizationEventNETHard+SoftEvents+FragmentsFragmentseeeeeeMMM+·(Stable)M+·*M+·图电子轰击分子示意图1、电子轰击电离（electronimpactionization,EI）3636优点：1）稳定,质谱图再现性好，便于计算机检索及比较；2）离子碎片多，可提供较多的分子结构信息。缺点：1）样品必须易于气化；2）当样品分子稳定性不高时，分子离子峰的强度低，甚至不存在分子离子峰。372化学电离（chemicalionization,CI）化学电离是通过离子-分子反应来完成的。反应气体一般是甲烷、异丁烷、氨等,生成(M+H)+,(M-H)+,(M+NH4)+的准分子离子。37优点：准分子离子峰强度高，便于推算分子量；缺点：1）只适用于易挥发、受热不分解的样品；2）碎片离子峰少，强度低。例：CH4+eCH4+·+2eCH4+·+CH4CH5++CH3·CH5++MCH4+(M+H)+CH5++MCH4+(M-H)++H23838CO2C8H17CO2C8H17149100200300400100435771113167EIm/z0100113m/z0100200300400149CI(CH4)261279391CI(CHMe3)100m/z0391100200300400相对丰度/(%)相对丰度/(%)相对丰度/(%)(a)(b)(c)(a)EI源(b)CI源（甲烷）(c)CI源（异丁烷）图1-4邻苯二甲酸二辛酯的质谱图39393场电离（fieldionization,FI）和场解吸（fielddesorption,FD）场解吸：原理与FI相同，但样品是被沉积在电极上。FD适用于难汽化的、热不稳定样品。FD的准分子离子峰比FI的强，质谱图比FI的还要简单。场电离：是一种软电离技术。当样品蒸汽邻近或接触到带高正电位的金属针时，由于高曲率的针端产生很强的电位梯度，样品分子可被电离。优点：电离快速，适合于和气相色谱联机；缺点：要求样品汽化，灵敏度低。40404快原子轰击（fastatombombardment,FAB）FAB：是一种广泛应用的软电离技术。快原子轰击利用的重原子一般为He或Ar。Ar+(高动能的)+Ar(热运动的)Ar(高动能的)+Ar+(热运动的)Ar+枪Ar+ArAr(6kV)碰撞室样品探头MS分析系统图FAB离子源原理示意图电离室4141FAB可完成连FD都有困难的、高极性、难汽化的化合物的电离。FAB得到的是准分子离子峰(M+H)+;当分析极性样品（糖类），常加入NaCl水溶液，得到(M+Na)+离子峰。4242MALDI的方法：将被分析化合物的溶液和某种基质溶液相混合。蒸发掉溶剂，则被分析物质与基质形成晶