P-糖蛋白介导药物相互作用的研究方法#

糖蛋白介导药物相互作用的研究方法#邢海艳1，何新1,2**（1.天津中医药大学中药学院，天津300193；2.天津市现代中药重点实验室，天津300193）5摘要：P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是由多药耐药基因（MDR）编码，在人体正常组织以及部分肿瘤细胞内表达的膜蛋白，它能够将选择性地将药物从细胞内转运外排出，从而影响药物吸收、分布与排泄。基于P-gp的药物-药物相互作用（drug-druginteractions,DDI）的研究对定向药物设计，缩短药物开发周期等起到促进作用。关于P-gp的DDI的研究方法主要包括体内法（invivo）、在体法（insitu）、体外法（invitro）等。本文就目前常用的10P-gp的研究方法及其特点进行综述。关键词：P-糖蛋白；基因敲出；肠灌流；肝灌流；单层细胞；ATP酶活力；MCF-7/ADR细胞中图分类号：R-33115MethodsofP-glycoprotein-mediateddruginteractionsXINGHaiyan1,HEXin1,2(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,TianJin300193;2.KeyLaboratoriesofTianjinmodernChinesemedicine,Tianjin300193)20Abstract:P-glycoprotein(P-gp)encodedbydrugresistantgeneandexpressedinhumannormaltissuesandinsometumorcells,isaveryimportantfactortolimitdrugabsorption,distribution,excretion,andmaybeafactorforsometumordrugtreatmentfailure;ResearchesonP-gpareveryimportantsignificanttoelucidatethedrug-druginteractions(DDI)basedonP-gp,canplayacatalyticroleindesigningdirecteddrug,reducingthedrugdevelopmentcycle.Weoftenuse25differentmethodstopredictdrugintestinalabsorptionanddistributionoftissuesandorgans,includinginvivo,insituandinvitro.Inthispaper,thecurrentmethodsforP-gpresearcharereviewed.Keywords:P-glycoprotein;Geneknockout;Intestineperfusion;Liverperfusion;Cellmonolayer;ATPaseactivity;MCF-7/ADRcell300引言P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是由多药耐药蛋白1（Multidrugresistance1，MDR1）基因编码的能量（ATP）依赖性膜蛋白，1976年由Juliano等[1]在中国仓鼠卵巢细胞中首次发现。P-gp能利用ATP水解释放的能量将药物等外源性物质从细胞内主动转运出细胞外，35从而产生多药耐药现象[2]。由于P-gp在人体内分布较广，如在血脑屏障、血睾屏障、肝脏、肾脏、胃肠道、胎盘等都有表达，它对临床常用药物的转运和处置起重要作用，与肿瘤的多药耐药密切相关，一直受到广泛关注[3-6]。由于P-gp分子上有多个药物结合位点，其转运的底物范围非常广泛，包括抗肿瘤药、降压药、抗心律失常药等[2,7]。因此在药物联合使用时，可能发生药物相互作用，影响药动学过程，从而产生良性或非良性的临床疗效改变，甚至产40生毒性[8-10]。近年来，P-gp介导的药物相互作用是国内、外研究的热点。目前已普遍采用组织细胞模型，基因敲出小鼠等作为P-gp介导的药物相互作用的研究工具，常用的包括人类结肠癌单层细胞系Caco-2、MDCK-MDR1细胞、mdr1a/1b(-/-)小鼠等模型[11-13]。本基金项目：教育部“长江学者和创新团队发展计划”（PCSIRT,No.IRT0973）；教育部高等学校博士学科点专项科研基金（No.20121210110011）；作者简介：邢海艳，（1989-），女，硕士研究生，中药药效物质与P-gp的相互作用研究。通信联系人：何新，（1966-），女，教授，博士生导师，药代动力学。E-mail:[e-mail]介导的药物相互作用的常用模型作综述。1体内研究方法（invivo）45药物体内转运过程研究是新药开发过程中必不可少的一个环节，该研究可以反映药物在体内吸收、分布、代谢、排泄的整体过程。在运用整体动物体内方法可以整体说明P-gp在吸收、分布、代谢、排泄在药物的影响。体内研究主要是基因敲出小鼠及正常动物模型等。1.1基因敲除动物小鼠、大鼠体内mdr1基因是由mdr1a（又称mdr3）和mdr1b（又称mdr1）编码，二者50在肝、肾、肺、心和脾高表达外，mdr1a在肠上皮细胞、血脑屏障和血睾屏障高表达，而mdr1b在肾上腺、怀孕子宫、和卵巢中高表达[2,14-16]。mdr1a基因敲除或者mdr1a/1b双基因敲除小鼠两者都可以用于关于P-gp的相关研究。通过比较药物在野生型小鼠与基因敲除小鼠的药物体内处置过程，阐明P-gp在吸收、分布、代谢、排泄等环节对药物的影响。AgarwalS等人[17]运用mdr1a/1b(-/-)、bcrp1(-/-)等基因敲出小鼠研究吉非替尼在血、脑分布情况，探55索mdr1及bcrp1是否是限制吉非替尼进入中枢神经系统的外排转运体。结果表明在mdr1a/1b(-/-)、bcrp1(-/-)等基因敲除小鼠体内吉非替尼的脑-血暴露量比明显高于野生型小鼠体内的脑-血暴露量比，揭示mdr1及bcrp1外排转运体参与吉非替尼在小鼠血脑屏障的外排作用，因此在运用该药物治疗疾病时可采用mdr1及bcrp1相应的抑制剂从而增加吉非替尼的体内暴露量，增加疗效。BeumerJH等人[18]运用mdr1a/1b(-/-)小鼠研究抗癌药曲贝替定的60体内分布及毒性研究，结果表明在P-gp存在条件下，曲贝替定迅速分布于各组织，并代被谢；在野生型小鼠体内他比特定产生蓄积并产生一定的肝脏毒性作用。1.2正常动物整体研究在新药开发过程中，经常运用小鼠、大鼠对药物的吸收、分布、代谢、排泄过程进行评价，该方法具有周期短、成本低、简单易行等特点[19]。而P-gp在大鼠及小鼠体内的分布亦65较广，若在研究药物吸收、分布、代谢、排泄的同时，联合使用P-gp的底物和抑制剂可以探索药物基于P-gp基础上的药物-药物相互作用（DDI）[20-21]。潘洪平等人[22]在研究葛根素在小鼠、大鼠体内的动力学过程，加入两种P-gp抑制剂维拉帕米组和槲皮素组对葛根素的体内吸收动力学相关参数的影响，探讨P-gp抑制剂对促进葛根素吸收的意义。结果表明无论在大鼠或小鼠体内维拉帕米和槲皮素均可明显提高葛根素的药时-曲线下面积70（AUC(0-Tmax)），维拉帕米和槲皮素均可明显促进葛根素的吸收，槲皮素还可明显延长葛根素的小鼠体内平均滞留时间。1.3药物诱导基因高表达一种药物基于P-gp产生药物-药物相互作用通常是通过以下三种方式：（1）该药物是P-gp的底物，可与其他底物竞争P-gp的结合位点，从而降低P-gp对药物的外排作用；（2）75该药物是P-gp的抑制剂，能够抑制P-gp的表达，使底物外排减少；（3）该药物是P-gp的诱导剂，使用该药物后P-gp高表达，从而使药物的外排增多。GreinerB等人[23]于1999年发现连续十天给予利福平（600mg/d）后，再给以1mg地高辛时，地高辛的吸收明显降低，提示利福平能够诱导P-gp高表达。现有大量文献报道利福平、苯巴比妥钠、地塞米松是P-gp的诱导剂，常用于P-gp高表达模型的建立[23-24]。WestphalK等[25]以连续九天给予利福平对80健康受试者进行P-gp高表达模型的建立后，发现静脉注射和口服他林洛尔曲线下面积显著中国科技论文在线降低，RT-PCR检测十二指肠发现P-gp表达提高4.2倍，提示利福平诱导P-gp介导他林洛尔的排泄，主要是在肠壁。2在体研究方法（insitu）自从1985年Pang等[26]建立大鼠原位肠、肝灌流模型并成功应用该模型研究依那普利的85吸收代谢及首过效应以来，该模型在药物吸收、代谢的研究中得到了广泛应用。在体研究方法主要是应用于完整动物实验，肠道、肝脏具有的血液供应和神经支配，能够直接反映药物的吸收、分布情况。主要有在体肠灌流法、肝灌流法。由于P-gp在肠道上皮细胞、肝脏中高表达，可以利用在体肠段与肝脏研究药物与P-gp的关系。2.1肠灌流法90在体肠、肝灌流是昀常用的方法，它包括振动灌流、循环灌流和单向灌流。一般情况下，采用单向灌流，如果药物的溶解度高、渗透量小时可以采用循环灌流[27]。本文主要就单向肠灌流作具体说明。按图1[19]装置进行肠灌流实验。用含有待测药物的灌流液先设置为1mL/min，10min后可设定恒定的速度单向灌流（一般为0.2mL/min)。在灌注过程中，滴生理盐水，加入到手术部位，然后用湿纱布覆盖，以避免干扰循环系统。试管样品采集前，采95集后立即进行了加权。在实验结束后，灌注肠段被削减立刻不伸展，沿肠系膜根部，打开仔细。的宽度和长度被测量和记录[27-29]。通过比较药物本身的肠有效渗透系数Peff值，及加入P-gp底物或抑制剂后得Peff值可以预测该药物是否是P-gp的底物后抑制剂。黄建耿等人[30]运用在体肠灌流技术研究塞利洛尔在十二指肠段、空肠、回肠与结肠段的吸收情况，并加入维拉帕米，帕朗尼克研究各肠端的吸收速率。结果显示维拉帕米与普朗尼克对各肠段塞利100洛尔吸收速率常数ka均增加，维拉帕米、普朗尼克对不同肠段ka与对照组比较，十二指肠段吸收速率常数ka无显著性差异（P0.05），空肠与回肠段有显著性差异（P0.05），结肠段有极显著性差异（P0.01）。灌流37℃对照十二指肠空肠回肠结肠105图1.在体肠灌流图[19]Fig1.Diagramofintestinalperfusion2.2肝灌流法该方法是将肝脏的血液循环与全身分离，通过肝血管系灌流药物，为仅经过肝脏而单纯110中国科技论文在线分析肝脏内药物转运的方法[27]。肝灌流实验一般是将门静脉作为灌流液入口，将肝静脉作为灌流液出口，通过测定灌流液入口和出口溶液的药物浓度差来阐明药物再肝脏中的药物转运情况，见实验装置图3[31]。Lau等[32]运用肝灌流模型研究有机阴离子转运多肽（OATP-2）与P-gp对地高辛处置的影响，研究发现加入OATP-2的抑制剂利福平后地高辛的曲线下面积（AUC）增大，加入P-gp的抑制剂奎尼丁后地高辛的AUC减少，说明OATP-2与P-gp115均参与了地高辛的代谢过程。图2.在体肝灌流图[31]Fig2.Schemeoftheliverperfusionsystem[31]1203体外研究方法(invitro)体外细胞模型是近年来研究P-gp昀常用的手段，该方法具有简单、快速、可靠等特点[11,19]。下面就单层细胞模型，ATPase试剂盒方法等方法作具体阐述。3.1单层细胞转运模型细胞转运模型主要依赖于高