高通量测序在临床精准诊断中的应用

高通量测序（NGS）在临床精准诊断中的应用高尚先先研究员博导中国食品药品检定研究院高通量测序成本迅速下降第一次人类基因组测序耗时13年，成本30亿美元，到2008年11月，基因组测序仅需一两周，花费10万美元。新一代仪器可将全基因组序列测序成本降到1000美元以下，成本不足第一代的百万分之一。而且随着技术进步，仍在不断下降。成本快速下降，测序领域的超摩尔定律助推临床应用测序设备发展现状3第一代（稳定需求）ABi3130xL(FDACFDA)3730xL3500xL（FDACFDA）第三代LifeTechnologies(ABi)IonTorrentPGM™HelicosBiosciencesHelicosGeneticAnalysisSystemPacificBiosciencesRSSystem第二代（高速发展）RocheGenomeSequencerFLXSystemGSJuniorSystemIlluminaGenomeAnalyzerIIxMiSeqHiSeq1000HiSeq2000HiSeq2500LifeTechnologies(ABi)5500SOLiD™System5500xLSOLiD™SystemDanaherMotionPolonatorG.007CompleteGenomics无锡艾吉因生物信息技术有限公司AG-100深圳华因康基因科技有限公司（CFDA）Pstar-1中科院北京基因组所/半导体所BIGIS-1BIGIS-4各类高通量测序技术原理高通量测序技术在临床中的主要应用范围出生缺陷相关分子诊断中的应用无创产前检测领域中的应用（NIPT）染色体畸变检测领域中的应用（CNV-seq）胚胎植入前遗传学筛查领域中的应用（PGS）肿瘤相关分子诊断中的应用遗传性肿瘤突变检测（Germline）肿瘤组织体细胞突变检测（Somatic）液态活检（LiquidBiopsy）出生缺陷防治，任重而道远。“……据估计，目前我国出生缺陷发生率在5.6%左右,每年新增出生缺陷数约90万例。出生缺陷不仅影响儿童的生命健康和生活质量，而且影响整个国家人口素质和人力资源的健康存量，影响经济社会的健康可持续发展。”——《中国出生缺陷防治报告（2012）》新生儿2000万出生缺陷婴儿100万6‰染色体疾病10‰单基因疾病30～40‰多基因疾病11‰智力障碍20～30‰各种畸形染色体核型发病率唐氏综合征47，+211/700爱德华氏综合征47，+181/3000帕陶氏综合征47，+131/10000特纳综合征45，XO1/3000活产女婴克氏综合症47，XXY1/1000活产男婴出生缺陷分为染色体疾病、单基因和多基因疾病NGS在无创产前检测领域中的应用（NIPT）NIPT的科学基础–血浆游离胎盘DNA胎儿游离DNA：cell-freefetalDNA（cffDNA）Lancet.1997胎盘来源母体外周血含有的cffDNA，几乎全部来源于胎盘滋养层细胞。检出时限怀孕4周可检出，8周后含量上升并稳定存在。12无创取样-抽血孕周范围广–12周到26周质控容易–不依赖孕妇年龄孕周等因素、容易建立标准实验规范不受上一胎影响NIPT相较临床常见产前检测技术的优势检测技术检测孕周描述血清学筛查（唐氏筛查）10-12周；16周左右5%的假阳性率；20%-40%漏诊率绒毛膜取样10-13+6周侵入性；有一定的流产风险羊水穿刺16-20+6周侵入性；有一定的流产风险脐静脉血穿刺20-28周侵入性；有一定的流产风险无创DNA产前检测（NIPT）12-26周非侵入性，安全；准确率99%以上多国出台NIPT指南国际专业协会发表NIPT指导意见美国妇产科医师学会（ACOG）和美国母胎医学会（SMFM）美国遗传学咨询协会（NSGC）国际妇产科超声协会（ISUOG）国际产前诊断协会（ISPD）加拿大妇产科医师协会（SOGC）美国医学遗传学及基因组学学院（ACMG）意大利母胎医学协会美国都是CLIA（ClinicalLaboratoryImprovementAmendments）认证机制，无FDA批准公司ACAOG201506262015.1.15卫计委妇幼司我国NIPT临床应用政策法规目的：完善技术规范明确在孕产妇人群中的适用范围界定其在整体产前筛查与诊断服务体系中的合理定位规范服务流程提高服务质量和管理水平高通量基因测序产前筛查与诊断技术规范（试行）NIPT的临床质量控制21三体综合征〉99%18三体综合征〉97%13三体综合征〉90%检出率复合假阳性率不高于0.5%假阳性率复合阳性预测值不低于50%阳性预测值复合假阴性率约为0.3%假阴性率胎盘/胎儿染色体结构差异（也叫局限性胎盘嵌合，cpm）现象是由于发育造成的，机制主要是受精卵发育早期的染色体纠正，在正常孕妇群体里发生率约千分之1-5，是nipt假阳性发生的主要原因。这种现象在生殖领域（pgs）也存在，具体指囊胚活检样本与其内细胞团染色体结构不一致，发生比例要比孕期cpm高，大概1-10%，因为研究难度较大，具体数字还没有共识。NIPT的未来发展空间大测序深度染色体非整倍体唐氏综合征、爱德华氏综合征、等染色体微缺失微重复综合征Digeorge综合征、猫叫综合征、等单基因病耳聋、地中海贫血、苯丙酮尿症、等…AAGCTTGCGACTTCAGTTAGCGCTAAGCCAGTGCATG…NGS在染色体畸变检测领域中的应用（CNV-seq）染色体疾病结构异常缺失、重复非平衡易位环状、等臂等数目异常多倍体非整倍体CNV-Seq应用领域流产原因查找产前（羊水、脐血）检测不孕不育原因查找染色体疾病先证者的染色体异常检测CNV-Seq技术操作流程CNV-Seq针对的人群产前诊断：具有染色体疾病家族病史的夫妇死胎、反复性流产，需要查明原因的夫妇曾经生育有出生缺陷患儿的孕妇染色体核型分析结果为正常，但超声显示结构异常的胎儿及其父母胎儿宫内发育迟缓先证者遗传病诊断：染色体核型分析正常，但临床表现为发育迟缓、智力低下、自闭、各种畸形、生育障碍等的患者及其父母其他医学检测为染色体疾病，需要确诊的患者NGS在胚胎植入前遗传学筛查中的应用（PGS)PGS临床流程检测内容：全部染色体非整倍体大于4Mb的新发的染色体微缺失/微重复大于1Mb的遗传自父母的染色体微缺失/微重复使用范围:高龄患者（≧35岁）有反复流产史的患者（自然流产≧3次）反复胚胎种植失败的患者（失败≧3次）生育过染色体异常患儿的夫妇自身染色体数目或结构异常的夫妇严重的男性不育（SMF），少弱精子症、畸精症自愿接受胚胎染色体异常排查的夫妇PGS检测内容及适用范围对NGS在PGS应用的思考1.高灵敏NGS技术的测序环境防污染系统的建立单细胞测序操作者脱落细胞的污染？2.样本与植入物的一致性问题胎盘/胎儿染色体结构差异（也叫局限性胎盘嵌合，cpm）现象在生殖领域（PGS）也存在，具体指囊胚活检样本与其内细胞团染色体结构不一致，发生比例大概1-10%，因为研究难度较大，具体数字还没有共识。2.注册审批的难度1)国家标准物质研制2)临床试验的难点?NGS在肿瘤分子诊断中的应用*每10万人发病人数**每10万人死亡人数数据来源：全国肿瘤登记中心的《2012中国肿瘤登记年报》前十大肿瘤发病占肿瘤整体发病比例76.39%前十大肿瘤死亡占肿瘤整体发病比例84.27%发病率*每年新发3,120,000人死亡率**每年死亡2,700,000人肺癌，54人胃癌，36人结直肠癌，29人肝癌，29人食管癌，22人乳腺癌，21人胰腺癌，7人淋巴癌，7人膀胱癌，7人甲状腺癌，7人肺癌，46人肝癌，26人胃癌，26人食管癌，17人结直肠癌，14人胰腺癌，7人乳腺癌，5人白血病，4人脑癌，4人淋巴癌，4人多种临床肿瘤分子诊断需求全面的基因检测多种样本类型可进行疗效监测靶向用药相关基因化疗用药相关基因肿瘤易感性相关基因检测肿瘤发生相关基因检测血液样本小标本组织样本大标本组织样本准确定量遗传性肿瘤突变检测（Germline）临床应用：检测多种肿瘤的患病风险；检测肿瘤基因型，判定家系成员患病风险；指导肿瘤个性化治疗。科研应用快速、低成本的探索肿瘤相关基因的突变；若采用毛细管测序的技术，一次只能检测一条DNA片段，需要大量人力，成本高，且需要大量DNA样本。、茱莉BRCA1阳性针对肿瘤基因外显子或SNP多态性位点进行NGS检测。肿瘤组织体细胞突变检测（Somatic）肺癌Lung结肠癌Colon黑色素瘤Melanoma胃癌Gastric卵巢癌OvarianEGFRKRASKRASBRAFBRAFKITKITPDGFRAAKT1PIK3CAAKT1PIK3CAGNAQKRASAKT1FGFR2AKT1ERBB2ALKPTENAPCPTENMAP2K1NRASPIK3CAp53PTENp53BRAFp53CTNNB1SRCPIK3CAPTENCTNNB1MAP2K1EGFRp53METNRASFBXW7METNRASIndustryGuidelinesEmergingandClinicalTrials指导肿瘤的个体化治疗很多肿瘤患者无法进行活检或手术；穿刺受检者严重不适感；穿刺自身的临床风险；取材时间点受限，很难进行多次取样；肿瘤异质性。基于组织的肿瘤体细胞突变检测的局限性液态活检(LiquidBiopsy)SpeicherMR,PantelK.Tumorsignaturesintheblood[J].Naturebiotechnology,2014,32(5):441-443.循环肿瘤细胞(Circulatingtumorcells,CTCs)游离肿瘤DNA(CirculatingtumorDNA,ctDNA)目前看，ctDNA更适合做液态活检作为无法获取组织标本的补充，无创取样后的检测结果指导临床用药实现实时动态监测，预测耐药及复发提高全程管理水平指导用药实时监测循环而匀质的血液标本，在一定程度有效克服异质性匀质标本未来可用ctDNA血液检测进行突变状态的动态耐药复发监测肿瘤类型繁多，分子突变特点不一；高灵敏度定性、定量检测，技术分辨率要求高；ctDNA来源复杂，不同肿瘤患者个体差异较大，数据解读与注释需谨慎；目前仍局限于晚期肿瘤的临床应用；需要大规模、多中心临床验证数据。ctDNA检测技术面临的挑战对NGS在肿瘤应用的思考1.肿瘤风险易感基因检测对诊断的价值？数据库的积累？预测的精准性？23andme？2013年11月26日，FDA叫停健康基因检测服务。2015年3月：批准其布卢姆综合症基因携带者检测服务(一种隐性遗传病)。BRCA1、BRCA2----乳腺癌易感基因，药物靶点（奥拉帕尼）2.肿瘤相关突变基因检测的诊断价值？1）小panel基因突变累积-----大panel基因突变累积都在用，那个合适？小panel2）ARMS—PCR法(灵敏度（病理切片/新鲜组织）国外roche，qiagen5%，国内1%？TKI必要性？NGS（1%随测序深度增加）数字PCR（0.5%）3）ctDNA液态活检灵敏度应大于1%NGS数字PCR应该用更灵敏的方法3.注册审批的难度1)国家标准物质研制的难点?如EGFR位点很多2)临床试验的难点对照试剂?谢谢！