20141223---高通量测序技术在肿瘤诊断与治疗中的应用

高通量测序技术在肿瘤诊断与个体化治疗中的应用吴晨肿瘤是一种基因病基因过表达与突变同病异突变传统突变检测的局限性NGS测序的历史高通量测序:一次性对几百万到十亿条DNA分子进行并行测序，又称为下一代测序技术，其使得可对一个物种的转录组和基因组进行深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深度测序。High-throughputSequencingNextGenerationSequencingDeepSequencing高通量测序简介（NGS）文库扩增低通量Sanger测序高通量测序并行测序高通量无需建立文库，两端加测序接头PCR扩增ExomesequencingTranscriptomesequencingGenomesequencingTargetedsequencinga:Roche/454,Life/APG,Polonatorb:Illumina/SolexaSolid-Phaseamplificationc:AppliedBiosystemsSOLiDsystemd:HelicosBiosciences:onepass454测序流程IlluminaSolexa测序流程ABISOLiD测序原理平台454SolexaSOLiDPCR磁珠乳化PCR桥式PCR磁珠乳化PCR测序载体磁珠玻片玻片测序方式焦磷酸、荧光可逆终止物、荧光连接酶、荧光结果序列FastQFastQCSFastQ三种平台的技术差异1.对于研究区域比较严格定义的时候，Agilent平台更适合。2.Illumina平台能够捕获UTR区域，其他平台不行。3.Agilent能检测到最多的SNP及插入缺失。科研应用（潜在临床应用前景）外显子组测序ExomeSequencingAllowsforRapidGeneIdentificationinaCharcot-Marie-ToothFamilyAnnualNeurology冰桶挑战让我们进一步认识了进行性神经性肌萎缩综合征。全外显子测序分析了这一罕见家系存在的基因突变类型（罕见病家系）10HBV（+）HCCwithPVTTsandmatchedcontrolsIllumina/SolexasequencingABISOLiDsequencingIdentificationofcandidatesomaticmutations.IdentificationofsomaticindelsPCR-basedSangerresequencing.基因组DNA打断外显子捕获富集文库建立测序原始数据下机数据过滤质控ShootingGun参考序列无有Indel,SNP统计氨基酸突变研究GO功能分析KEGG通路分析测序深度评估测序覆盖度评估测序随机性评估分析内容测序评估外显子组测序WeiX,WaliaV,etal.ExomesequencingidentifiesGRIN2Aasfrequentlymutatedinmelanoma.NatGenet黑色素瘤发生率一直在上升，此研究对黑色素瘤细胞进行外显子组捕获测序，发现了和其相关的高频突变基因。（某种类型疾病与暴露因素相关性研究）基因组DNA打断外显子捕获富集文库建立测序原始数据下机数据过滤质控ShootingGun参考序列无有Indel,SNP统计氨基酸突变研究GO功能分析KEGG通路分析测序深度评估测序覆盖度评估测序随机性评估分析内容测序评估七个新发现的非同义高频突变位点单个基因中突变位点分析基因GRIN2A模式图，箭头表示突变位点Whatcan/wouldwedo?基于全外显子测序的家族遗传性肿瘤疾病易感性研究（以下以胃癌为例）胃癌（GastricCancer）全球：第四大常见癌症；第二大癌症死亡率平均5年存活率22%，晚期5年存活率低于5%，男女发病率2:1中国：恶性肿瘤中居首位，西北与东南沿海地区发病率更高风险：家族遗传、HP、饮食结构、癌前胃部疾病、吸烟等家族遗传因素：胃癌病人亲属的胃癌发病率较普通人高4倍以上10%胃癌在家族中遗传1%-3%为CDH1基因突变带来的家族弥漫性胃癌，其他原因目前未知罕见类型或特殊病理类型！家族性胃癌是指：高发病率区(如中国)一级和(或)二级亲属中≥3例患病其中1例是另2例的一级亲属连续两代发病至少有1例发病年龄＜50岁。突破点在于：1、发现罕见疾病家系2、收集完整家族血液样本3、剔除抑制突变、SNP及同义突变4、发现新的突变SNPcopynumber肥胖与HP（+）胃癌的关系研究胃癌（GastricCancer）全球：第四大常见癌症；第二大癌症死亡率平均5年存活率22%，晚期5年存活率低于5%，男女发病率2:1中国：恶性肿瘤中居首位，西北与东南沿海地区发病率更高风险：家族遗传、HP、饮食结构、癌前胃部疾病、吸烟等家族遗传因素：肥胖和肿瘤是全球两大重要的公共卫生问题。肥胖可以增加胃癌罹患率,并且治疗效果差、肿瘤病死率高,但具体机制尚不清楚。肥胖与胃癌均存在一定家族遗传性全外显子捕获测序获得初筛数据Step1Step2Step3先证者母亲父亲DNA/RNAExtractionNext-generationSequencing数据库比对SNV、indelanalysis、mutantgenesRT-PCR、IHCoftargetgenesintissuesofproband功能研究BloodSamplesInvitro/vivostudy5TrioswithHP（+）TissuesTRIO家庭三口之家肥胖的定义1.BMI:25kg/㎡normal25~30kg/㎡overweight30kg/㎡obesity2.WHRorWHtR（waist-to-hipratioorwaist-toheightratioMale：0.95obesityFemale：0.8obesity三人同时满足！HP（+）的定义胃镜取活检标本检查，分离培养+直接涂片检查+病理切片未经任何治疗胃癌的定义胃镜取活检标本检查，病理检测未经任何治疗腺癌(包括乳头状腺癌、管状腺癌、粘液腺癌、印戒细胞癌)先证者一人满足！C14呼气试验能否确诊HP（+）？实验组对照组3-5TRIOs肥胖家庭非肥胖家庭HP（+）外显子测序普通测序验证DeNovo突变体外及动物实验3-5TRIOsHP（+）外显子测序普通测序验证DeNovo突变体外及动物实验其他标准：性别比TNM分期先证者年龄质控•标本采集：TRIO全血采集（与测序公司讨论所需血样体积），采用抗凝管•DNA提取（QIAmpDNABloodMinikit）及保存（1）样品纯度：OD260/280值应在1.8～2.0之间；RNAfree。（2）样品浓度：最低浓度不低于50ng/µl。（3）样品总量：每个样品总量不少于15µg。（4）样品溶剂：溶解在H20或TE（pH8.0）中。（5）保存：DNA低温运输（-20℃，干冰）临床应用基于测序的肿瘤个人疾病ID建立与个体化治疗方案癌症突变用药数据库其他优势数万份案例临床实验数据库NCCN及FDA数据库结合人群用药情况（中国）专人监测，实时更新血液样本监测遗传信息监测二/三期临床药物推荐私人订制！肿瘤样本测序肿瘤基因突变基因多态性分析肿瘤突变谱基因多态性个体化肿瘤治疗指导•石蜡包埋组织切片或组织块•新鲜冰冻组织•血液和骨髓•其他检测流程CDKMDM2反馈调节p21GD-AIFBAI-1TSP血管生成因子抗血管生成因子p53ATMMDR逆转化疗抗性细胞周期阻滞NKa(II)PH细胞凋亡促进作用抑制作用肿瘤患者ID