pcr基础知识TAKAR--ppt课件

WelcomeToPCR基础知识主要内容一.PCR技术的发明二.PCR技术原理三.PCR反应组分及反应条件四.PCR实验操作五.PCR应用六.TaKaRaPCRCyclerDiceTP650v20世纪50年代初，威尔金斯等意识到DNA是一种螺旋结构。v1951年底，弗兰克林在拍摄到一张清晰的DNA的X射线照片。v1952年，鲍林发表关于DNA三链模型的研究报告。v1953年3月7日，沃森和克里克成功搭建DNA双螺旋模型。v1953年4月25日，沃森和克里克在《自然》杂志上发表名为“核酸的分子结构--DNA的一种可能结构”的论文，阐明DNA双螺旋结构及碱基配对和半保留复制机理。上世纪最重要的三个重大发现之一DNA双螺旋结构的发现沃森&克里克v20世纪60年代末70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术，但由于核酸的含量较少，在一定程度上限制了DNA的体外操作。v1971年Khorana最早提出核酸体外扩增的设想：DNA经过变性，与引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程，便可合成tRNA基因。体外获得双链DNAPCR技术的发明v1985年Kary.B.Mullis教授发明了具有划时代意义的PCR技术。PCRPolymeraseChainReactionvPCR(聚合酶链式反应)技术是一种体外快速扩增特定DNA片段的方法。v运用PCR技术能快速特异地扩增所希望的目的DNA片段，使皮克(Pg，10－12）起始物达到微克（μg，10－6）水平。早期PCR技术v最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段。vKlenow酶不耐热，DNA模板热变性时，导致此酶钝化，每加一次酶只能完成一个扩增反应周期。v使用耐热的DNA聚合酶和自动热循环仪。v短时间内获得大量的目的DNA片段拷贝。现在的PCR技术主要内容一.PCR技术的发明二.PCR技术原理三.PCR反应组分及反应条件四.PCR实验操作五.PCR应用六.TaKaRaPCRCyclerDiceTP6502.PCR原理PCR原理演示理论扩增曲线实际扩增曲线PCR扩增曲线主要内容一.PCR技术的发明二.PCR技术原理三.PCR反应组分及反应条件四.PCR实验操作五.PCR应用六.TaKaRaPCRCyclerDiceTP650PCR反应基本组分vDNAPolymeraseDNA聚合酶vdNTP四种脱氧核苷酸vBuffer缓冲溶液vPrimerF/R引物（上游/下游）vTemplate模板PCR技术中常用的酶vDNA聚合酶vRNA聚合酶v反转录酶DNA聚合酶v不耐热大肠杆菌聚合酶Ⅰ的Klenow片段。PCR反应过程中易失活。v耐热TaqDNA聚合酶。PCR反应过程中不易失活。TaKaRaDNA聚合酶的选择TaKaRaDNA聚合酶的选择dNTP四种脱氧核苷酸v组成：dATP、dTTP、dGTP、dCTP。v浓度：溶液中最终使用浓度为20~200uM。大于1mM会抑制Taq酶活性。v保存：高浓度原液，PH7.0，-20℃，分装保存。v易与Mg2+络合。Buffer缓冲溶液vBuffer选择：不同的酶不同buffer。v保存：10倍浓度-20℃保存。vMg2+添加情况：Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。PCR引物v引物的设计：设计原则。v引物的退火温度Ta：Ta=Tm-5。引物小于20mers：Tm=(G+C)×4+(A+T)×2引物小于20mers：Tm=81.5+0.41×(GC)%-600/Lv引物的最终浓度：0.1μM到1μM。引物浓度低，扩增产物少；引物浓度高，容易会引起错配、非特异扩增、二聚体。PCR模板v纯度：越纯越好。纯度判定：1.8D260/D2802.2。专用提取的试剂能提取到高纯度的核酸。纯度不好，可用PCI及EtOH精制。v浓度：模板浓度用ng/μL或copies/μL表示。浓度高，降低扩增效率，增加非特异扩增。PCR反应条件PCR反应条件三步反应条件二步反应条件94℃1min.94℃1min.94℃30sec.98℃10sec.55℃30sec.30cycles30cycles72℃1min./Kb68℃Xmin.72℃5-10min.72℃10min.4℃soak4℃soak主要内容一.PCR技术的发明二.PCR技术原理三.PCR反应组分及反应条件四.PCR实验操作五.PCR应用六.TaKaRaPCRCyclerDiceTP650PCR实验操作v移液枪的基本操作v混合液配制操作v实验结果分析v防止污染移液枪的基本操作v选择量程合适的移液枪。v调整移液量。v安装一次性吸液枪头。v预洗。v吸液。v放液。v退枪头。移液枪正确的操作移液枪常见的错误操作v拿移液枪的姿势不对v量程与枪头不配套v安装枪头不规范v吸液时枪头插入太深或过浅产生气泡v吸液时过快v放液后枪头仍有残留混合液配制操作过程1.确认反应体系，计算使用试剂体积。2.准备实验器具：冰盒、移液枪、stand、tube、tip等，并用酒精擦拭桌面及实验器具。3.准备试剂：-20℃取出酶、dNTP、Buffer、Primer等，融化混匀。4.小心吸取反应组分，加入Tube中，轻轻混匀。注意移液枪使用、试剂添加顺序。5.分装混合液。混合液粘，注意吸取；分装到Tube底部。6.PCR仪反应。普通PCR实验过程最终产物PCR仪反应琼脂糖凝胶电泳整个过程3-4小时配置混合液实验结果分析1.电泳液选择。TAE、TBE2.电泳方式选择。恒流、恒压······3.胶的选择。琼脂糖胶：1％、3％······PAGE胶：8％、15％······胶浓度根据pcr产物大小选择4.Marker的选择。根据胶浓度、pcr产物大小选择实验结果实例v好的实验结果胶面整洁、条带明亮清晰、无拖尾、无非特异扩增······16SrDNA1Kbp扩增λDNA8Kbp、10Kbp扩增梯度扩增实验结果实例v非特异性扩增的实验结果HotStar抑制非特异扩增非特异扩增实验结果实例v失败的实验结果阴性对照污染无目的产物扩增日常工作中的污染原因1.标本间交叉污染2.PCR试剂的污染3.PCR扩增产物污染4.气溶胶污染············防止污染1.分区操作2.分装试剂3.实验操作注意事项1.分区操作防止污染1)试剂调制区实验服、手套、口罩、实验台、移液枪、stand、tube。2)样本处理区Tube、Tip、Stand、移液枪等最好专用、实验后实验台处理。3)产物分析区实验器具专用，Tube、PCR产物保存处理。2.分装试剂酶、引物、dNTP、Buffer等分装使用，尽可能减少污染几率。防止污染3.实验操作注意事项1)一次性手套2)使用一次性吸头3)避免反应液飞溅4)最后加入反应模板5)设立阴阳性对照和空白对照6)重复实验，验证结果，慎下结论。防止污染主要内容一.PCR技术的发明二.PCR技术原理三.PCR反应组分及反应条件四.PCR实验操作五.PCR应用六.TaKaRaPCRCyclerDiceTP650PCR反应特点v简便、快速v特异性强v灵敏度高v对标本的纯度要求低v基因、DNA片段的克隆v人工基因构建vDNA序列测定v基因定点突变v基因型（突变）检测，vSNP分析，遗传背景分析v生物物种鉴定，系统进化研究v基因表达量研究（real-timePCR）v基因表达谱研究PCR应用PCR应用v免疫-PCRv多重PCRv重组PCRv不对称PCRv反向PCRv标记PCR和彩色PCRv原位PCR技术主要内容一.PCR技术的发明二.PCR技术原理三.PCR反应组分及反应条件四.PCR实验操作五.PCR应用六.TaKaRaPCRCyclerDiceTP650TaKaRaPCRCyclerDiceTP650TP650特长v外观精巧，体积小，重量轻。v滑动机盖，方便放置样品。v控制面板角度可调，操作灵活。v弹出式菜单显示，功能选择更简单。v曲线温度表示方式，画面清晰。v适合长链PCR扩增。v可进行TouchdownPCR反应。······v外观精巧，体积小，重量轻，节省空间。体积小：260（W）×345（D）×260（H）mm重量轻：11.5kg（实机重量）TaKaRaPCRCyclerDiceTP650v滑动机盖，方便放置样品。v控制面板角度可调，操作灵活。TaKaRaPCRCyclerDiceTP650仪器规格TaKaRaPCRCyclerDiceTP650外形尺寸260（W）×345（D）×260（H）mm重量11.5kg（实机重量）额定电源电压AC100～240V,50/60Hz,4.9A（100V时）顶盖加热方式保持在110℃左右加热速度最大3.0℃/秒冷却速度最大2.0℃/秒温度设定范围4～99.9℃（最小单位0.1℃）程序数可储存100个程序User登录数10个SampleBlock96孔面板展示蓝、白自选············实验例1：v使用TaKaRaTaq进行λDNA8kbp扩增，检测扩增性能及96个反应孔间均一性。TaKaRaPCRCyclerDiceTP650反应体系、反应条件TaKaRaPCRCyclerDiceTP650反应体系反应条件PCRBuffer1×94℃1min.dNTPmixture200μM94℃30sec.primer10μMeach30cyclesλDNA1ng65℃10min.TaKaRaTaq1.25U4℃soakupto50μlTaKaRaPCRCyclerDiceTP650实验结果实验例2：v使用TaKaRaLATaq进行λDNA35kbp扩增，检测长链PCR扩增性能。TaKaRaPCRCyclerDiceTP650反应体系、反应条件TaKaRaPCRCyclerDiceTP650反应体系反应条件PCRLABuffer1×94℃1min.dNTPmixture200μM98℃10sec.primer10μMeach68℃15min.λDNA1ng72℃10min.TaKaRaLATaq2.5U4℃soakupto50μl30cycles实验结果TaKaRaPCRCyclerDiceTP650TaKaRa介绍TaKaRaBio株式会社宝生物工程(大连)有限公司DNA限制酶、DNA修饰酶、PCR试剂盒等生物工程研究用试剂，DNA合成、DNA测序、DNA芯片制作.。宝日医生物技术（北京）有限公司以细胞治疗为中心的生物工程领域的技术开发与服务，销售生物工程研究用的试剂与相关设备。公司推行独家代理的营销方式湖北地区的独家代理：武汉亚法生物技术有限公司经理：郑翚电话：[phone]