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叶绿体色素的提取、分离、理化性质鉴定及含量测定实验目的：分析校园中两种植物材料叶绿体色素的差异内容：①叶绿素a和b含量差异；②绿色素与黄色素的含量差异色素提取分离的原理;叶绿素测定的方法及其原理；绿色素与黄色素的纯化原理及步骤；叶绿素的理化性质的鉴定方法实验原理PhotosynthesisThermosynechococcuselongatus(蓝细菌)PSIPSII光合色素的脂溶性-----酒精、丙酮等有机溶剂提取Chl是双羧酸的酯---皂化反应---叶绿素与类胡萝卜素分离Chl的取代反应：卟啉环中的Mg2+可被H2+、Cu2+、Zn2+取代光学特性：•ChlaChlb有两个强吸收峰----含量测定时选择叶绿素特有的红光吸收峰波长；第二单线态10-12S第一单线态10-9S基态能量三线态10-3~10-2S分子内能量传递传向反应中心吸收430nm光吸收670nm光680nm荧光热能热能热能磷光Chl的荧光和磷光现象----反射光中能观察到呈红色的荧光；叶绿素化学性质不稳定，光容易受强光的破坏叶绿体色素的分离方法•纸层析方法：根据色素在不同有机溶剂中的溶解度不同以及在吸附剂上的吸附能力不同，可将它们彼此分离开。（定性，小量）（今天选择做）•皂化反应和萃取分离方法（大量，定量）叶绿素a和b含量的测定方法—分光光度法•根据Lambert-Beer定律：OD1=Ca·ka1+Cb·kb1（1）OD2=Ca·ka2+Cb·kb2（2）Ca=12.7OD663-2.69OD645（3）Cb=22.9OD645-4.68OD663（4）CT=Ca+Cb=8.02OD663+20.21OD645（5）•Ck=4.7OD440-0.27Ca+b叶绿体色素的理化性质（1）叶绿素与类胡萝卜素都有一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定；（2）叶绿素在光照下可产生暗红色的荧光；（3）叶绿素的化学性质很不稳定，易受强光破坏；（今天选择做）（4）叶绿素中的镁可被H+取代而成褐色的去镁叶绿素；加入铜盐作用，后者则成为绿色的铜代叶绿素。实验材料和器材•实验材料：（两组组合，每组做一种植物材料，最后两组结果放在一起分析）•器材：721型分光光度计、电子天平、量筒、研钵、剪刀、漏斗、滤纸、移液管（1mL）、试管及试管架、洗耳球、酒精灯等。•试剂：丙酮、80%丙酮、醋酸酮、5%盐酸、碳酸钙、石英砂等实验步骤鲜叶4g，加丙酮10ml及少许碳酸钙和石英砂，匀浆，以漏斗过滤之再加丙酮20ml洗并过滤，即为色素提取液。放于暗处备用。用于绿色素与黄色素的分离取20ml取3ml于另一试管中1滴1滴加浓盐酸，直至溶液出现褐绿色加醋酸铜晶体少许，慢慢加热溶液，则又产生鲜亮的绿色分别观察在反射光和透射光一侧，提取液的颜色有无不同；观察色素溶液的吸收光谱取少许于另一试管中23415实验步骤取20ml色素提取液加到盛有20ml乙醚的分液漏斗中，摇动绿色素与黄色素的分离沿漏斗边缘加入30ml蒸馏水，轻轻摇动分液漏斗，静止10分钟，溶液即分为两层。弃去下层水相；再用蒸馏水冲洗乙醚溶液1次，弃去下层水相。加入8ml30％KOH甲醇过饱和溶液，用力摇动分液漏斗5分钟以上，皂化要彻底，直至颜色变为棕褐色静置约10min加蒸馏水约10ml，摇动后静置分离，则得到黄色素层和绿色素层分别收集并保存于试管中5观察色素溶液的吸收光谱(1)调节分光计，观察电灯光的光谱；(2)观察色素丙酮提取液，用丙酮将溶液稀释1倍比较之；(3)观察黄色素乙醚溶液，用乙醚将溶液稀释1倍比较之；(4)观察皂化叶绿素甲醇溶液，用甲醇将溶液稀释1倍比较之；（今天选择做）(5)观察铜代叶绿素溶液。（今天选择做）实验步骤实验步骤叶绿素a和b的测定鲜叶0.5g，加丙酮5ml及少许碳酸钙和石英砂，匀浆，将匀浆转入量筒中，并用适量80%丙酮洗涤研钵，用80%丙酮定容至10ml吸取2.5ml加入有10ml80%丙酮的量筒中，过滤，滤液备用取上述色素提取液4ml，以80%丙酮为对照，分别测定663nm、645nm和440nm处的光密度值。按公式（3）、（4）、（5）分别计算色素提取液中叶绿素a、叶绿素b、及叶绿素a+b的浓度，类胡萝卜素浓度。再根据稀释倍数分别计算每g鲜重叶片中色素的含量。注意事项•实验中注意安全，石油醚、丙酮等试剂要远离火源。尤其注意做铜代反应时避免伤人。•研磨过程中丙酮要少量多次加入，以免研磨时四处飞溅。•叶绿素要避光保存。实验作业1按照规范写出实验报告，以两组结果比较进行结果分析与讨论。2.色素分离开始三次加蒸馏水的目的是什么，加乙醚的作用又是什么？下次实验内容1和教师讨论自己的方案的最后时间节点2选择学习光合强度的测定