乙肝疫苗生产发展简介

基因工程产品的成功例证生物技术应用的典范甲基营养型酵母-----汉逊酵母重组酵母乙肝疫苗HepatitisBVaccine疫苗的生产1，灭活死疫苗•患者---分离出致病微生物（细菌或者病毒）-----通过培养细菌（培养基）或者病毒（细胞），获得大量的致病微生物---用甲醛灭活（杀死）致病微生物---纯化---铝吸附-----灭活死疫苗。2，减毒活疫苗•患者---分离出致病微生物（细菌或者病毒）-----通过改变培养条件，获得不再致病微生物---培养不再致病微生物，获得大量的不再致病微生物---铝吸附-----减毒活疫苗。乙肝病毒的体外培养至今没有成功•前面，我们已经讲过，细菌要在培养基中繁殖，病毒要在细胞中繁殖，比如，流感病毒在鸡胚细胞中生长，狂犬病毒要在地鼠肾细胞中生生长，乙脑病毒要在vero细胞中生长。可是乙肝病毒在所有实验过的细胞中都不能生长。乙肝疫苗的研究受到了严重的困难。人们不得不寻求其他的途径去生产乙肝疫苗。乙肝抗原的来源•1，乙肝患者的血液：血源性乙肝疫苗。•2，利用DNA重组技术构建重组微生物（酵母）表达（合成）乙肝抗原：基因工程乙肝疫苗乙肝疫苗发展历史•1,1963年Blumberg发现在血友病患者的血清中存在一种抗体，这种抗体能与澳大利亚土著人血液中的一种抗原起交叉反应，这种抗原被命名为“澳大利亚”抗原。•2,1968年Prince在血清型肝炎（乙型肝炎）患者血清中发现抗原性与澳大利亚抗原相同的病毒样颗粒，进而初步认定澳大利亚抗原就是乙肝表面抗原。•3,1970年Dane用电子显微镜在乙肝患者血清中发现直径为42nm完整乙肝病毒颗粒及直径为22nm的球形和杆形的乙肝表面抗原。•4,1971年Krugman发现加热处理的急性期乙肝患者的血清能部分预防乙肝感染。•5,1981年Merck公司在世界上首次研制成功第一代乙肝疫苗——血源性乙肝疫苗。•6,1985年北京生物制品研究所在国内首次研制成功血源性乙肝疫苗.•7,1986年Merck公司在世界上首次研制成功第二代乙肝疫苗-----重组酵母乙肝。•8,1989年北京生物制品研究所与Merck公司签订合同，引进重组酵母乙肝疫苗工业化生产技术。1993年5月开始试生产。•9,90年代德国莱茵生物技术公司发展了一种甲基营养型酵母---汉逊酵母表达系统,其乙肝表面抗原表达水平可达到500-1000mg/L.南韩绿十字疫苗公司应用该表达系统实现了重组汉逊酵母乙肝疫苗的大规模工业化生产。•10,大连高新（汉信）生物制药有限公司从1998年开始重组汉逊酵母乙肝疫苗的研制工作，在2002年6月获得了国家药品监督管理局颁发的“新药证书”，在2003年开始商业化生产。•11,华兰生物在2009年也将开始重组汉逊酵母乙肝疫苗的生产。乙肝疫苗的发展历史•第一代乙肝疫苗；血源性乙肝疫苗。•第二代乙肝疫苗；基因工程乙肝疫苗。基因工程乙肝疫苗•1，CHO细胞乙肝疫苗。•2，重组酿酒酵母乙肝疫苗。(第一代重组酵母乙肝疫苗）•3，重组汉逊酵母乙肝疫苗。(第二代重组酵母乙肝疫苗）•乙肝疫苗的发展历程：n80年代初期-----血源性乙肝疫苗（第一代乙肝疫苗）。1995年停产。n80年代中期----基因工程乙肝疫苗（第二代乙肝疫苗）。包括：•重组酿酒酵母乙肝疫苗，表达水平不理想—50mg/L。5ug/0,5ml的成人剂量偏低，抗体滴度偏低。•重组CHO细胞乙肝疫苗，表达水平低，2-5mg/L，母婴阻断效果不理想•重组牛痘病毒乙肝疫苗。表达水平低，1-3mg/L，无法实现工业化生产。n90年代初期---重组汉逊酵母乙肝疫苗。更先进的基因工程乙肝疫苗。国外主要的乙肝疫苗生产厂家厂家疫苗美国默克公司Merck重组酿酒酵母乙肝疫苗比利时史克公司Smithkline重组酿酒酵母乙肝疫苗法国巴斯德研究所PasteurMerieux重组CHO细胞乙肝疫苗德国莱茵公司下属的韩国绿十字疫苗公司GreenCross重组汉逊酵母乙肝疫苗国内主要的乙肝疫苗生产厂家厂家疫苗北京天坛生物制品股份有限公司(北京生物制品研究所）重组酿酒酵母乙肝疫苗深圳康泰生物制品公司重组酿酒酵母乙肝疫苗华北药厂和长春生物制品研究所等重组CHO细胞乙肝疫苗大连高新(汉信）公司和华兰生物疫苗公司重组汉逊酵母乙肝疫苗国内乙肝疫苗生产厂家工艺比较厂家种菌发酵细胞破碎粗纯精纯吸附北京深圳啤酒酵母四级发酵高压破碎硅胶吸附疏水层析原位吸附大连汉信汉逊酵母四级流加球磨破碎PEG硅胶吸附DEAE分子筛区带普通吸附华兰生物汉逊酵母四级流加高压破碎硫酸铵沉淀疏水DEAE分子筛普通吸附公司菌种的表达水平纯化的收率北京深圳50mg/L20%大连汉信150-200mg/L15%华兰生物200-300mg/L20%新乡华兰，大连汉信，北京天坛•华兰：菌种好，表达水平高，纯化收率高，所以，总体而言，华兰公司的技术更为先进。•北京生物制品研究所(天坛生物)生产的乙肝疫苗的基本情况：•生产技术：从美国MERCK公司引进。•年产量：1000万人份，3000万支。•生产设备：从美国购进。•基本技术资料：•菌种：重组酿酒酵母•表达水平：50mg/L•表达效率：1,35%(表面抗原蛋白/酵母总蛋白）•纯化收率：20%•发酵罐工作体积：500L•一次发酵所得抗原量：50mg/Lх500L=25g•纯化后所得抗原量25gх20%=5g•可生产疫苗量5,000,000/5=1,000,000支•北京天坛的弱项和不足：表达水平低，抗原数量少，每剂疫苗只含5微克或10微克的抗原，比华兰疫苗抗原含量少一倍，所以抗体滴度低和抗体持续时间较短。北京天坛和新乡华兰表达水平和抗原产量的比较表达水平抗原产量北京天坛50微克低新乡华兰300微克高北京天坛和新乡华兰疫苗抗原含量和抗体反应的比较每剂疫苗抗原含量抗体滴度抗体持续时间北京天坛5微克（儿童）10微克（成人）低短华兰公司10微克（儿童）20微克（成人）高长大连汉信和新乡华兰纯化步骤和纯化收率的比较纯化步骤纯化收率大连汉信多低于20%新乡华兰少高于20%汉逊酵母和啤酒酵母的比较重组汉逊酵母的特点（甲基营养型酵母）•甲基营养型酵母：以甲醇为唯一能源和炭源的酵母。1,多个HBsAg基因拷贝被整合到染色体中，遗传稳定性好。2,发酵过程中不产生乙醇，黏度小，可实现高密度培养。3,高效表达HBsAg400-1000mg/L。4,发酵过程中均使用化学合成培养基，不使用酵母粉等营养成分，生产成本低。5，生物安全性好，汉逊酵母是存在于土壤，水中的一种酵母种群。它不含人和动物的病原体，不产生内毒素。按照国外基因技术法规，汉逊酵母被列为基因操作生物安全性1组。与酿酒酵母属同一生物安全等级。国外生物安全委员会还将汉逊酵母选为典型的工业菌株的研究模型。重组汉逊酵母乙肝疫苗生产工艺菌种小三角瓶大三角瓶种子发酵罐生产发酵罐细胞破碎去除细胞碎片疏水层析离子交换层析凝胶过滤除菌过滤铝吸附种子批系统SEEDLOTSYSTEM•在乙肝疫苗的生产过程中采用种子批系统，即由原始种子批制备主代种子批，由主代种子制备工作种子批，每次发酵都由工作种子批中取一支菌种接种三角瓶.种子批保存在液氮或－80℃的冰箱中。其目的是为了批与批之间菌种的差别降至最低。重组汉逊酵母乙肝疫苗的人体试验结果A，小学生：选择348名健康小学生（HBsAg,抗-HBs,抗-HBc阴性）年龄在6-9岁之间，随机分为3组，每组接种1批疫苗，免疫剂量为10ug/0,5ml,免疫程序为0，1，6，第1剂免疫后3，7，12月采血样，用Abbott试剂盒检测抗-HBs，并观察副反应。结果如下：重组汉逊酵母乙肝疫苗免疫小学生抗体阳转率和抗体GMT疫苗批号人数3个月7个月12个月抗体阳转率%抗体GMT抗体阳转率%抗体GMT抗体阳转率%抗体GMT50111497,87230,598,25897,1100,0791,650210795,19246,6100,0915,6100,0875,1503127100,0311,699,21932,596,77867,6结论：1，重组汉逊酵母乙肝疫苗免疫小学生后副反应轻微。2，重组汉逊酵母乙肝疫苗免疫小学生后抗体阳转率和抗体水平较高。重组汉逊酵母乙肝疫苗的人体试验结果B，母婴传播：选择HBsAg,HBeAg双阳性母亲所生新生儿45名，按0，1，6免疫程序接种10ug/0,5ml重组汉逊酵母乙肝疫苗,采集第1剂免疫后3，7月血样，并检测。同时，还免疫了41名健康母亲所生的新生儿和5名HBsAg阳性,HBeAg阴性母亲所生的新生儿做比较。其结果如下：重组汉逊酵母乙肝疫苗免疫新生儿后的抗体反应母亲新生儿数抗-HBs阳转率（%）抗-HBsGMTHBsAgHBeAg3个月7个月3个月7个月++4591,1141/4593,3342/45236,6615,5+-5100,04/4100,05/5223,9677,3--4185,3735/41100,041/41344,3634,5重组汉逊酵母乙肝疫苗免疫新生儿的阻断母婴传播保护效果母亲人数HBsAg阳转率保护率HBsAgHBeAg3个月7个月阳性阳性452,22(1/45)4,44(2/45)95,07%阳性阴性50,00(0/4)0,00(0/4)阴性阴性412,44(1/41)0,00(0/41)结论：阻断母婴传播的效果好，保护率达到较高水平，（95,07%）。由于重组汉逊酵母表达水平高，使重组汉逊酵母乙肝疫苗含有足够量的抗原，抗原浓度比其它乙肝疫苗高出一倍，成人：20ug/ml,婴儿，儿童：10ug/0,5ml。因而，免疫后产生的抗体不仅滴度高，而且抗体持续时间长。重组汉逊酵母乙肝疫苗的特点：三高•1，抗体阳转率高。•2，抗体滴度高。•3，母婴阻断率高。用重组汉逊酵母表达产物—乙肝表面抗原制备的重组汉逊酵母乙肝疫苗是新一代的乙肝疫苗，它在临床实验中有优秀的三高”表现，，即抗体阳转率高，抗体滴度高，母婴阻断率高。乙型肝炎病毒感染的预防：I，被动免疫：免疫球蛋白（ImmuneGlobulin)免疫球蛋白是将HBsAg阴性供血者的血液经低温乙醇分段法而制成，其中anti—HBs的含量不确定，所以预防乙型肝炎病毒感染的作用也是不明确的。使用免疫球蛋白的唯一理由是当时无法获得特异性乙肝免疫球蛋白（HBIG）乙型肝炎病毒感染的预防：特异性乙肝免疫球蛋白（HBIG）特异性乙肝免疫球蛋白是将anti-HBs阳性供血者的血液经低温乙醇分段法而制成，其中anti—HBs的含量是确定的，所以对乙肝病毒暴露后的预防作用也是确定的。经低温乙醇分段法而制备的特异性乙肝免疫球蛋白是安全的，没有证据表明它会传播AIDS。特异性乙肝免疫球蛋白（HBIG）的使用•什么情况下使用特异性乙肝免疫球蛋白（HBIG）•1，伤口和黏膜意外暴露于HBsAg—阳性血液。•2,HBsAg—阳性母亲所生的新生儿。•注意：在注射特异性乙肝免疫球蛋白（HBIG）后，还应同时注射乙肝疫苗。特异性乙肝免疫球蛋白（HBIG）的注射剂量和注射途径；•伤口，黏膜意外暴露，0,06ml/kg.最大剂量：5ml.•HBsAg—阳性母亲所生的新生儿。0,5ml。•肌肉内注射。.乙肝疫苗的接种剂量:分组RecombivaxHB（默克）EngerixB（史克）剂量(ml)剂量(ml)HBsAg(-)母亲的婴儿11yrs的儿童2,5(ug)0,510,0(ug)0,5HBsAg(+)母亲的婴儿5,0(ug)0,510,0(ug)0,511`--19yrs青少年5,0(ug)0,520,0(ug)1,020yrs成年人10,0(ug)1,020,0(ug)1,0透析患者40,0(ug)1,040,0(ug)2,0母婴阻断•1，HBIG+HBVaccine被证明是母婴阻断的有效措施。90%左右的婴儿可被保护（母亲，HBsAg+,HBeAg+)•2，0,5ml的HBIG在出世12小时内肌肉内注射。•3，婴儿离开医院前，HBVaccine肌肉内注射。•4，HBIG和HBVaccine也可以同时在不同部位注射。•5，1个月和6