基于NGS的微生物多组学在人体微生态领域的...

邓旭旭高级产品经理[e-mail]安诺优达基因科技（北京）有限公司基于NGS的微生物多组学在人体微生态领域的应用Contents目录人体微生态介绍及研究思路人体微生态经典案例解析人体微生态四大研究方案人体微生态介绍及研究思路人体微生态overviewByrdA.L.,et.al.Nature.2014.SenderR.,etal.Cell.2016.人体微生态overviewB:H≈1.3:1如何定义健康菌群？Lloyd-PriceJ.,etal.GenomeMedicine.2016.从组成、功能动态变化、生态学功能等方面来定义健康微生物组不同健康人群中的共有物种不同健康人群中的共有核心酶类、代谢通路等利用简化的自由能级图模型来描述健康微生物组的动态变化健康微生物组也可以用生态学形成模式来定义口腔食管胃小肠消化道肠道——“体内的母亲河”大肠下游上游中游被遗忘的精准医疗重要领域SunX.,etal.NatureReviewsDrugDiscovery.2016.被遗忘的精准医疗-人体微生态微生态制剂发明专利公司名称成立时间关注领域主要产品与状态融资情况SeresTherapeutics2010传染性疾病及新陈代谢、炎症性疾病Ecobiotic®drugs、SER-109/临床试验、SER-287/临床一期四次融资，共1.335亿美元SecondGenome2009感染性、免疫性及代谢类疾病SGM-1019/临床试验2016年融资4260万美元Vedantabiosciences2010自身免疫性疾病和炎症VE-202/临床前研究2016年融资5000万美元基于微生态的医疗公司现状微生态疾病人体肠道菌群文章发表趋势Pubmed:Search(microbiota[Title/Abstract])ANDgut[Title/Abstract])050010001500200025003000350020002001200220032004200520062007200820092010201120122013201420152016Publicationsongutmicrobiota微生物研究动态Science特刊关注肠道微生物组2016年，三篇report，3篇review，一篇perspective文章，涉及生活习惯对肠道菌群的影响、粪便移植、肠道菌群与免疫，肠道菌群与抗生素等领域。人类微生物计划HumanMicrobiomeProject简称：HMP2007年肠道宏基因组计划MetagenomicsoftheHumanIntestinalTract简称:Meta-HIT2010年地球微生物宏基因组计划EarthMicrobiomeProject简称：EMP2011年美国国家微生物组计划NationalMicrobiomeInitiative【扬帆起航】2016年5月13微生物研究国际计划微生物研究国际计划中国微生物组计划（CMI）研究方向:“6+2”模式6个领域:人体、环境、农作物、家养动物肠道、工业以及海洋;两个方向:微生物组研究方法及应用技术平台和微生物组数据储存及功能挖掘。微生物样本分离纯培养仅能检测＜1%的微生物物种分子生物学技术微生物群落结构的全面解析传统方法2007年前，分子生物学方法高通量测序PCR-DGGE实时荧光定量PCR克隆文库微生物培养工作量大：克隆—构建载体—转化—单克隆选择—一代测序微生物态的研究技术基础宏转录组测序宏基因组测序mRNA差异表达和代谢通路功能基因分析和代谢通路物种组成、群落结构……16S/18S/ITSSequencing测序技术研究目的基于高通量测序的微生态研究方法单菌株denovo测序单菌株的基因组信息、致病性16SrDNA测序是最常用的细菌分类标准。通过对指定环境中微生物16SrDNA高变区PCR扩增产物的高通量测序，分析该环境下微生物群落的多样性，包括物种的分类信息和丰度信息等。研究对象：特定环境中细菌或古细菌。16SrDNA基因测序16SrDNA的结构特点V1V2V3V4V5V6V8V7V90100200300400500600700800900100011001200130014001500341F806R515F806R18SrDNA的结构18SrDNA/ITS基因测序18SrDNA/ITS测序是常用的真菌分类标准，指定环境中真菌的高变区的扩增产物进行高通量测序，反映不同样本的物种间差异，分析该环境下微生物群落的多样性，包括物种的分类信息和丰度信息等。研究对象：特定环境中真菌群落。ITS的结构一般用于海洋微生物样本宏基因组测序（Metagenomic）测序技术测序策略指标宏基因组测序IlluminaHiseqPE1506Gbrawdata/样本适用研究领域以特定环境中整个微生物群落作为研究对象，不需对环境中微生物进行分离培养，利用高通量测序平台进行测序，可以鉴定所有微生物组成及种类、系统进化、功能注释，样品间的物种或基因差异以及物种间的代谢网络等分析。基于NGS的微生物研究技术比较16S/18S/ITSrRNA基因测序宏基因组测序Wang,etal.NatureReviewsGenetics.2014.16SrDNA测序宏基因组测序多样性分析/宏基因组技术的区别1•16S/18S/ITS测序•有哪些物种存在2•宏基因组测序•有哪些功能基因存在物种组成、群落结构、Alpha&Beta多样性分析等功能基因、代谢通路等独有技术精准宏基因组技术研究目的：除了常规的宏基因组分析外，还可以发掘低丰度物种；显著改善微生物基因组组装效果，甚至能组装出draftgenome。梯度稀释单细胞文库及测序低丰度物种、draftgenome精准宏基因组“三要素”如何理解精准宏基因组测序？Opportunitiesenabledbysingle-cellsequencingstrategiesGawadC.,et.al.NatureReviewsGenetics.2016.宏基因组测序精准宏基因组测序单细胞微生物测序技术优势应用领域：可用于各种环境微生物群落，特别适合低丰度群落。海底极端环境永久冰川北极冻土其它稀有珍贵样品……..精准宏基因组单细胞微生物技术研究目的鉴定微生物群落中新微生物；单细胞层级上的重测序。研究策略流式细胞分选特定微生物单细胞，进行MDA扩增后进行初步筛选；对候选样本进行建库测序分析，最后对新物种鉴定与验证。针对某些难以培养的微生物也可以进行基因组层面的重测序分析。注：由客户提供单细胞样本。独有技术研究思路—overview症状表型健康记录临床医学研究临床信息采集：BMI血糖血压蛋白代谢因子…….生物机制研究物种组成、功能基因、代谢通路...临床诊断与治疗效果靶标鉴定与分子机制研究思路—toolsWeinstockG.M.,Nature.2012.研究流程选择适宜实验材料实验重复设置样本采集和DNA质量检测确定测序数据量和测序平台信息分析比较策略信息分析（标准+个性化）取样策略（keypoint）重复性选择性一致性关联性多个体，多位点，大样本量，以排除个体之间的差异遗传背景、生活饮食习惯、生长环境、性别年龄、取样方法、提取方法一致排除有严重病史、使用抗生素、有药物依赖等个体采集与研究疾病相关的生理生化指标，研究致病性原因欲解决的问题科学问题如何定植？与人体互作的机制？疾病发展中的作用？研究热点定植（来源与时空规律）？对肠道屏蔽、免疫系统的影响？与疾病的关联？转化难点诊治标识过多，难以临床验证？治疗靶标不明确？潜在预防标识较多？转化医学诊断标识？治疗靶标？预防标识？人体微生态经典案例解析肠道菌群经典案例解析（1）疾病类癌症、炎症性肠病、血栓等研究（2）非疾病类肥胖、抗生素抗性研究肠道菌群人体微生物质量分布图人体正常菌群种类1000余种；主要分布于肠道、皮肤、口腔、呼吸道、泌尿生殖道，大多定植肠道；肠道微生物主要有细菌、古细菌、真菌及病毒，其中99%以上为细菌；各部位由不同特异性肠道菌群构成；人体微生物组和人体基因组组成超个体(Superorganism)，共同参与人体正常功能。肠道是人体微生态菌群分布重要场所结肠癌、大肠癌IBD（克罗恩病和溃疡性结肠炎）代谢综合征：糖尿病，肥胖动脉粥样硬化，冠心病，心脑血管疾病等过敏性疾病精神性疾病：孤独症，焦虑抑郁，慢性疲劳综合征等艾滋病风湿性疾病：类风湿性关节炎（RA）王子恺，杨云生.解放军医学杂志，2012彭丽华，杨云生.中华消化杂志，2013肠道微生物与人类疾病影响肠道微生态的因素内在因素胃酸氧气动力粘液胃肠分泌抗菌肽免疫（sIgA）外在因素饮食益生菌PPI，H2抗生素动力药泻药NSAIDs阿片肽影响肠道微生态的构成或功能Simre´nMagnus,etal.Gut.2013.影响肠道微生态的因素来自MicroClub-LCH.肠道菌群与致病性之间的关系Roundet.al.naturereviewsimmunology.2009免疫系统失衡，致病菌趁虚而入，造成人体疾病Moya&Ferrer,etal.trendsinmicrobiology.2016.肠道生态系统的功能性冗余模型：肠道菌群与宿主基因、蛋白、代谢组、肠道屏蔽（肠道粘膜、上皮细胞）的关联性肠道微生态的研究的材料临床上肠道菌群的研究一般以粪便为样品；样本采集一般取后面出来的粪便，建议取粪便中间样本，因为粪便表层含有肠粘膜脱落细胞；优点：无创，取样较为便捷。人肠道菌群可以取粪便样本，也可以通过解剖动物来取得肠道内容物样本；优点：可以研究肠道不同部位的菌群。动物模型肠道菌群、肠道菌群与癌症—perspective肿瘤微生物组ThomasRM.,etal.Trendsincancer.2015.Trendsincancer：癌症与微生物组综述1、肠道菌群与癌症：overview肠道粘膜处组织由健康到恶性肿瘤的过程以及微生物在其中的致病过程GarrettW.S.,etal.Science.2015.Science：癌症与微生物组综述研究样本：70个病人（59个结直肠癌、21个肠息肉患者）、59个正常个体；43个粪便和59个粘膜样本文库构建：16S文库，V3/V4区测序平台及策略：IlluminaMiSeq平台,PE2501、肠道菌群与癌症FlemerB.,etal.Gut.2016.结直肠癌中与癌症相关&不相关的微生物结肠直肠癌患者粘膜的微生物群与健康人不同微生物组成及基因表达的改变不仅限于肿瘤组织，并且这些改变在与肿瘤组织距离不同的部位也不尽相同研究结果展示健康与病人OTUs的co-abundancenetworkanalysis结肠直肠癌患者粘膜的微生物群与健康人不同。微生物组成及基因表达的改变不仅限于肿瘤组织，并且这些改变在与肿瘤组织距离不同的部位也不尽相同。研究结果展示2、肠道菌群与炎症性肠病研究样本：235个病人、38个健康个体的粪便样本；文库构建：16S文库：V3-V4区；ITS文库：ITS1区测序平台及策略：16S&ITS：IlluminaMiSeq，PE250与疾病有关的物种SokolH.,etal.Gut.2016.炎症性肠病中真菌微生物的失调细菌群落的变化真菌群落的变化研究结果展示与IBD有关的细菌和真菌物种研究结果展示3、肠道菌群与血栓研究样本：3年内，4007个人样本；无菌小鼠若干研究技术：LC-MS/MS、16SrRNA测序测序平台：IlluminaMiSeq，PE250ZhuW.,etal.Cell.2016.肠道菌群代谢氧化三甲胺，增加血小板高反应性和血栓形成的风险TMAO与血栓形成有密切的关系肠道菌群在血栓形成过程中起到关键作用研究结果展示无菌小鼠接受不同食物而导致肠道菌群的变化研究结果展示血浆中TMAO水平的升高预示血栓形成的风险增加；TMAO能极大的激活依赖性血小板；在体内，