MSI诊断检测的方法和应用

MSI诊断检测的方法和应用主要内容微卫星不稳定的相关背景MSI的检测意义MSI检测方法MSI检测试剂盒背景介绍微卫星不稳定性(microsatelliteinstability,MSI)是指与正常组织相比，在肿瘤中某一微卫星由于重复单位的插入或缺失而造成的微卫星长度的任何改变，出现新的微卫星等位基因现象。主要机制：①DNA多聚酶的滑动导致重复序列中1个或多个碱基的错配②MS同源重组导致碱基对的丢失和插入1993年，Altonen等首次发现，在HNPCC细胞中存在高频率的MSI。目前已发现MSI的肿瘤主要有3类：一类为HNPCC病人发生的结直肠癌、子宫内膜癌以及卵巢癌,这一类肿瘤几乎都表现为MSI；另一类为散发性结直肠癌,这一类肿瘤发生MSI概率约15％～30％；第三类为包括肺癌、乳腺癌和胰腺癌在内的其它肿瘤,这一类肿瘤MSI发生频率相对较低。背景介绍结直肠癌是是常见的消化道恶性肿瘤，我们每年有13万-16万人罹患结直肠癌，其发病率占肿瘤发病率的第三位，仅次于肺癌和胃癌。HNPCC是常见的遗传性肿瘤综合症，遗传性结直肠癌是一个常染色体遗传疾病,目前研究表明微卫星不稳定性可能是遗传性结直肠癌发生的重要机制。背景介绍具有MSI的散发性结直肠癌,具有不同的临床病理、分子生物学特征,表现为:发病年龄较小；对某些化疗药物(如5-FU、顺铂等)有原发性耐药;生物学行为较好。MSI-H是Ⅱ期结肠癌预后良好的一个标志物，也是患者不能从氟尿嘧啶单药辅助化疗获益的疗效预测指标。背景介绍微卫星不稳定检测的意义1.检测MSI可以用于检测是否为Lynch综合征结直肠癌的遗传易感性包括一些研究较清楚的遗传性综合征，例如Lynch综合征（又称之为遗传性非息肉病性结直肠癌，HNPCC）和家族性息肉病（FAP）。在HNPCC和散发性直肠癌中的微卫星不稳定性是遍布整个基因组的现象，并且可能是导致癌症发生的普遍机制。专家组推荐，MMR蛋白检测应强烈建议在所有50岁以下的结肠癌患者中开展，原因在于该群体中患Lynch综合征的可能性增加。而且，在一些中心，现在对所有的结直肠肿瘤组织进行免疫组化检测（有时分析MSI）以来决定哪些患者需要进行Lynch综合征相关的基因检测.微卫星不稳定检测的意义2.检测MSI可以用于判断患者预后高危Ⅱ期患者，定义为预后较差者，包括：T4（ⅡB、ⅡC期）、组织学分化差（3/4级，不包括MSI-H者），已经有大量证据表明MMR蛋白表达缺失或MSI-H是Ⅱ期结肠癌预后良好的一个标志物。具有MSI-H肿瘤的Ⅱ期结肠癌患者，3/4级分化（低分化）不再认为是高危因素。微卫星不稳定检测的意义3.检测MSI以判断是否需要辅助化疗对于Ⅱ期结肠癌是否需要辅助化疗，在做临床决策时需要考量的一个重要信息就是微卫星不稳定性（MSI）。研究认为MMR基因为MSI-H（高度微卫星不稳定）会对顺铂、卡培他滨及5-FU产生耐药性，相反MSI-L、MSS的患者不会产生耐药。微卫星不稳定检测的意义一项研究长期随访了Ⅱ/Ⅲ期结肠癌患者后发现，MSI-L或MSS者通过5-FU辅助化疗确实改善了预后；然而，MSI-H者却不能从术后5-FU辅助化疗中显著获益，与单纯手术相比，5-年生存率反而更低。微卫星不稳定检测的意义免疫组化方法(IHC)免疫组化方法仅用于与肿瘤细胞中的MLH1,MSH2,MSH6和PMS2蛋白结合。如果没有结合任何的蛋白，就证明发生了MSI。2.直接测序法对MMR基因各区域（MLH1、MSH2、MSH6等）的扩增产物直接测序。3.多重荧光PCR采用多重荧光PCR的方法对NCI建议的位点进行扩增，以确定MSI状态。检测MSI方法比较方法灵敏度特异性重现性时间成本操作IHC~90%低低3-5天500~1000复杂直接测序法80~100%高高5-7天1000~2000简便多重荧光PCR100%高高2-3天500~1000简便MicroreadMSI检测试剂盒阅微基因根据NCCN指南，针对结直肠癌基因诊断领域研发了MSI检测的试剂盒。微卫星不稳定（microsatelliteinstability，MSI）检测试剂盒是一款以多重荧光PCR技术为基础的基因突变检测系统，一次扩增检测6个MSI位点，操作简便、快速。扩增检测位点位点GenBank®Number重复序列产物范围1标记荧光类型NR-27AF070674(A)2770-91HEXNR-21XM_033393(A)2192-113FAMBAT-26U41210(A)26160-185FAMBAT-25L04143(A)25105-125HEXNR-24X60152(A)24119-139TMRMONO-27AC007684(A)27155-177TMRPentaCAL138752(AAAAG)3-15190-250FAMPentaDAC000014(AAAAG)2-17151-224HEXAmel--107/113TMRMSI检测送样要求若客户提供石蜡切片，则要求厚度5-20μm的石蜡切片（切片中确保含有9mm2以上大小的组织块）10片或以上，注明石蜡包埋组织的保存年限，组织类型和包埋前处理方式等。若客户提供DNA样品，则从新鲜组织提取的DNA最佳，20ng/μl以上的DNA20μl即可（需提供DNA浓度）；若为石蜡包埋组织提取的DNA，除了提供DNA的浓度（20ng/μl以上的DNA至少20μl）外，还需提供琼脂糖凝胶电泳图MSI检测试剂盒使用方法DNA提取：根据样本不同，采用二甲苯或Chelex100的方法提取DNA；PCR扩增：毛细管电泳检测：按照[（0.5μlROX500）×样品数]+[（8.5μl甲酰胺）×样品数]制备好样品，RUN3130xl遗传分析仪。组分20μl体系(μl)MasterMix无核酸酶超纯水6.02.5×PCRMix8.05×MSI引物混合物4.0模板DNA2.0反应总体积20.0操作流程示意图数据分析目的峰：A.单核苷酸标记的位点NR21、Bat26、NR27、Bat25、NR24、Mono27的峰型均为类似五指的手掌峰，见图2；图2单核苷酸标记位点峰型示意图B.五核苷酸重复的位点PentaC、PentaD和性别位点Amelogenin的峰型均为单峰型，见图3。图3五核苷酸标记和性别位点峰型示意图非目的峰：pull-up峰、stutter峰、染料峰、加A不完全峰等。数据分析MSI判定结果微卫星不稳定MSI-H型根据NCI建议，与正常样本比较，有2个发生改变可称定为MSI-H型，只有1个出现不稳定的为MSI-L型，没有出现突变的情况为MSS型。微卫星不稳定MSI-L型MSI判定结果微卫星稳定MSS型MSI判定结果MSI检测试剂盒优点基于MSI的NCIpanel标准开发了适合中国人群的MSI检测系统；采用多重荧光PCR技术，一次扩增和检测6个准单态性单核苷酸微卫星基因座，其中5个与国外检测相吻合，另外增加了一个适合中国人群的位点；基于测序仪的基因分型研究领域拥有多年的经验和多项成果，已经做了超过1000例病例样本，积累了丰富的经验和数据基础。MSI检测案例XBH-XXBH-1*接收委托方两份样本，正常组织XBH-X和肿瘤组织XBH-1，要求鉴定肿瘤组织的MSI状态，正常对照样本分型正确，肿瘤组织样品在BAT-26、NR-27、BAT-25、NR-24和MONO-27等5个位点出现双峰。该肿瘤组织为MSI-H型。13MS6E13MS6C*接收委托方两份检材，分别为肿瘤组织13MS6C和正常组织13MS6E，要求检测该肿瘤组织的MSI状态，6个单核苷酸位点均未出现MSI，鉴定结果为MSS稳定状态。MSI检测案例阅微基因诊断试剂简介脆性X综合征检测试剂盒五种特性检测脆性X综合征：准确计算CGG重复数、灵敏度高于Southern杂交、可识别女性纯合子及杂合子、检测AGG插入、结果100%可重复。白血病BCR-ABL1检测试剂盒检测三种最常见BCR-ABL1变体；可进行绝对定量；灵敏度达10-5；整合ARQ技术，检测结果稳定、准确；成本较低。Y微缺失检测试剂盒操作简便；8小时内得到结果；模版需要量低；检测位点包含EAA/EMQN指导意见位点；每个样品只需一个扩增检测反应；可检测AZFb、AZFc区各常见部分缺失及复制；可同时对克氏综合症进行检测。21三体综合征检测试剂盒周期短、准确性高、灵敏度高、可清晰判断样本污染情况、对于部分易位和嵌合体有更好的检出率阅微基因诊断试剂简介