上课用非常好基因工程

1.2基因工程的基本操作程序1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定基因工程基本操作的四个步骤一、目的基因的获取(一)、目的基因主要是______________________编码蛋白质的基因（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成阅读教材P8-11如：与生物抗性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因、具调控作用的因子等。非编码区非编码区编码区RNA聚合酶结合位点外显子内含子终止子基因的结构启动子原核真核原核细胞的基因结构非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游与RNA聚合酶结合位点启动子终止子①不编码蛋白质。：编码蛋白质,连续不间断编码区非编码区原核细胞的基因结构②调控遗传信息表达,上游的RNA聚合酶结合位点:启动子真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区内含子外显子启动子终止子编码区上游编码区下游真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用,上游有RNA聚合酶结合位点(启动子)。非编码序列：包括非编码区和内含子非编码序列：包括非编码区和内含子与RNA聚合酶结合位点原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的，边_________边_________编码区是间隔的、_____的，先_____后_____相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较连续不连续编码区非编码转录翻译转录翻译1．下列关于基因结构的认识中，正确的是（）A．大豆基因中内含子是能够编码蛋白质的序列B．乳酸菌与酵母菌基因结构中都存在外显子和内含子C．大肠杆菌基因与RNA聚合酶结合位点位于编码区的下游D．水稻细胞基因的编码区中存在非编码序列2．（多选）原核细胞与真核细胞基因结构的共同特点是（）A．编码区都有能编码蛋白质的序列B．编码区都是连续的C．非编码区都能调控遗传信息的表达D．非编码区都有RNA聚合酶结合的位点DACD1、从基因文库中获取目的基因（1）.基因文库将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。种类基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接重组载体基因组文库导入受体菌中储存（2）.基因文库的构建方法①基因组文库的构建提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA单链DNA双链cDNA片段重组载体与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶导入受体菌中储存②cDNA文库的构建-----逆转录法：mRNARNA－DNA杂合双链单链DNA双链DNA逆转录（cDNA）DNA聚合酶真核生物的基因用逆转录法得到的cDNA与原基因相同吗？有哪些差异？原核生物基因呢？思考？编码区非编码区非编码区DNA聚合酶剪接有关的酶RNA聚合酶mRNA前体mRNA单链DNAcDNA逆转录酶转录剪接逆转录复制启动子终止子基因不含非编码系列。即不含非编码区和内含子基因组DNA文库与cDNA文库的比较（3）构建基因文库的目的怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?便于在不知道目的基因核苷酸序列的情况下，获得所需的目的基因。依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性（4）从基因文库中得到目的基因的方法——直接分离法(鸟枪法)直接分离法供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离(鸟枪法)回顾必修课中目的基因的获取方法有哪些？多用于原核生物构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的A、染色体DNAB、线粒体DNAC、总mRNAD、tRNA目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是A、某生物的全套基因就是一个基因文库B、将含有某种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物体内，则这个生物就是一个基因文库C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库AC2、利用PCR技术扩增目的基因①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术。②原理：__________多聚酶链式反应体外特定DNA片段DNA复制5’5’3’3’5’3’5’3’DNA聚合酶DNA连接酶DNA复制的条件：模板DNA、脱氧核苷酸、解旋酶、引物酶、DNA聚合酶、DNA连接酶引物PCR技术•原理：•前提：•原料：•优点过程：PCR扩增仪DNA复制已知目的基因的一段核苷酸序列：以_____方式扩增，在短时间内大量扩增目的基因指数模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）；离子变性复性延伸③过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链d.重复a.b.c步骤：每重复一次，目的基因增加___倍一③过程：PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤条件：_______________________、_______________、___________、_____________、前提条件:________________⑥结果：模板DNA(含目的基因)四种脱氧核苷酸一对引物热稳定DNA聚合酶指数2n使____________________在短时间内成百万倍地扩增已知基因的核苷酸序列含目的基因的DNA片段DNA复制PCR技术场所原理条件解旋方式酶特点结果PCR技术扩增与DNA复制的比较碱基互补配对原则碱基互补配对原则四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高温下变性解旋解旋酶催化解旋半保留复制、边解旋变复制半保留复制、全解旋再复制体外复制主要在细胞核内大量的DNA片段形成整个DNA分子热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶、解旋酶、DNA连接酶等1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，理论上至少需要几个引物？2×（2n-1）(n为循环次数)（24-1）×2=30蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化学合成推测推测3、人工合成法：在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？反转录法目的基因的信使RNA目的基因化学合成法肽链氨基酸序列信使RNA序列基因的核苷酸序列目的基因合成人工合成法（真核生物）推测推测单链DNA合成那么原核生物和真核生物基因结构有没有区别呢？一、目的基因的获取1、从基因文库中获取2、利用PCR技术扩增3、人工合成种类基因组文库：含有一种生物的全部基因部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，如：cDNA文库课堂小结：2、下列属于获取目的基因的方法的是()①利用mRNA反转录形成②从基因组文库中提取③从受体细胞中提取④利用PCR技术⑤利用DNA转录⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥随堂闯关随堂闯关1．在已知基因的核苷酸序列的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法B、基因组文库法C、CDNA文库法D、聚合酶链反应3、在基因工程中，把选出的一个目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4次，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（）个A.540B.8100C.17280D.75601.加热至95摄氏度的目的是使DNA中的断裂，这一过程在细胞内是通过的作用来完成的。2.当温度降低时，引物与模板末端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板延伸，最后合成2个DNA分子，此过程中的原料，遵循的原则是。3.Taq酶的特点是（）A.耐强酸B.耐强碱C.耐高温D.最适温度37摄氏度4.请指出PCR技术与DNA复制过程的区别在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTG／TACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是①双链DNA分子为模板②ATGTG或TACAC模板链③四种脱氧核苷酸④四种核苷酸⑤DNA聚合酶⑥热稳定DNA聚合酶⑦引物⑧温度变化⑨恒温A．①③④⑦⑧⑨B．①②④⑥⑦⑧C．①②⑤⑥⑦D．①③⑥⑦⑧D在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是A.540个B.8100个C.17280个D.7560个B在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是A、化学合成法B、基因组文库法C、cDNA文库法D、聚合酶链反应下列获取目的基因的方法中需要模板链的是①从基因文库中获取目的基因②利用PCR技术扩增目的基因③反转录法④通过DNA合成仪利用化学方法人工合成A．①②③④B．①②③C．②③④D．②③AD（1）用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。（2）用___________切断目的基因，使其产生_________________。（3）将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶的黏性末端切口DNA连接酶相同1.过程:基因表达载体的构建质粒目的基因限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶表达载体同一种Hind限制性酶ⅠⅡHindIIIHindIII目的DNA质粒构建表达载体四环素抗性基因由于目的基因插入而失活，形成只具有氨苄青霉素抗性基因DNA连接酶人类胰岛素的基因2.基因表达载体的组成：它们所处的位置和有什么作用？a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因位于基因的首端,是mRNA结合位点位于基因的末端,终止转录检测目的基因是否导入受体细胞3、基因表达载体的作用a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代b、同时使目的基因能表达和发挥作用思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意目的基因与运载体结合所需的条件有①同一种限制酶②具有抗性基因的质粒③RNA聚合酶④目的基因⑤DNA连接酶⑥四种脱氧核苷酸⑦ATPA．①②③④⑤⑥⑦B．①②④⑤⑥⑦C．①②③