不同非植酸磷和基因工程酵母菌植酸酶水平对

不同非植酸磷和基因工程酵母菌植酸酶水平对43-63日龄黄羽肉鸡生长和胫骨发育的影响蒋宗勇，周桂莲，李得忠，蒋守群，陈芳，林映才，郑春田（广东省农业科学院畜牧研究所，农业部动物营养与饲料（华南）重点开放实验室，广东省动物育种与营养公共实验室，广州510640）摘要：本试验旨在研究不同非植酸磷（NPP）和植酸酶水平对黄羽肉鸡生长和胫骨发育的影响，以确定43-63日龄阶段黄羽肉鸡的营养需要量和植酸酶的磷当量值。试验选用43日龄健康、发育良好的快长型岭南黄羽肉鸡公鸡作为试验鸡，共设11个处理，每处理4个重复，每个重复30鸡，试验采用玉米-豆粕型基础饲粮，各处理间除饲粮磷和植酸酶水平不同外，其余营养水平均一致。处理1为基础饲粮，不添加磷酸氢钙和植酸酶。处理1、2、3、4、5、6、7的饲粮NPP水平分别为：0.08%、0.15%、0.22%、0.29%、0.36%、0.43%、0.50%，处理8、9、10在基础饲粮中分别添加200U/kg、400U/kg、600U/kg毕赤酵母基因工程菌植酸酶（PHYP），处理11在基础饲粮中添加400U/kg巴斯夫植酸酶产品。试验期21日。结果表明：在0.08%至0.36%NPP水平组间随NPP水平提高试鸡日增重显著增加（P0.05），0.36%NPP水平组日增重最大，除与0.29%NPP组无显著差异外，显著高于其他各组（P0.05），对照组采食量显著低于各加磷组（P0.05），0.36%NPP水平组采食量最高，显著高于其他各组（P0.05），0.43%与0.50%NPP水平组试鸡日增重与采食量显著低于0.36%NPP水平组，对照组与0.15%组试验鸡料重比显著高于其他各组（P0.05）。试鸡脱脂干骨重在0.36%NPP组达到最高，显著高于对照组和0.15%组（P0.05），0.29%、0.36%、0.43%组干骨中灰分含量显著高于对照组（P0.05），灰分中钙含量对照组最低，显著低于其他各加磷组（P0.05）。与对照组相比，添加两种植酸酶使试鸡日增重和采食量显著提高（P0.05），料重比显著降低（P0.05）。添加巴斯夫植酸酶显著提高了试鸡胫骨脱脂干骨重和干骨中钙含量（P0.05），添加PHYP酶显著提高了试鸡胫骨干骨灰分含量和干骨中钙含量（P0.05）。综合上述试验结果并对试鸡日增重与胫骨灰分含量进行非线性回归分析得出：43-63日龄阶段满足黄羽肉鸡最佳生长的NPP需要量为0.34%，满足黄羽肉鸡最佳骨骼发育的NPP需要量为0.37%，NPP水平超过0.43%时对试鸡生长有负面影响，PHYP磷当量为309U/g。关键词：非植酸磷；植酸酶；胫骨灰分；磷当量；岭南黄鸡我国肉用地方黄鸡生长速度较慢，但肉质细嫩、肉味鲜美，广东、台湾和香港的市场占有率在70%以上，上海、北京的肉用黄鸡市场也在迅速发展，并已引起国际市场的广泛关注，具有广阔的开发前景。近年来，有关黄羽肉鸡日粮代谢能、粗蛋白和氨基酸营养需求参数方面的研究已有陆续报道，但关于黄羽肉鸡磷营养需要的研究报道极少。磷是动物必需矿物元素，其重要性除了作为骨骼组成成分外，磷几乎对体内各种代谢过程都起着重要作用。缺磷会导致生长鸡饲料利用率下降，增重减慢，胫骨发育不良等，影响饲料的饲喂效果。另外，大量研究表明为了有效提高植物性饲料中磷的利用率，减少环境污染，最好的方法就是添加外源植酸酶。近年来，国内外研究者已在优良植酸酶的筛选、分离，以及通过蛋白质工程、基因工程进行酶学性质的改良和通过重组微生物反应器高效表达植酸酶，提高发酵效价等方面进行了大量研究（叶冰等，2002；齐连权等，2002；姚斌等，199；彭日荷等，2002）。由于现代肉鸡品种、品系之间生长速度、饲料转化效率、养分利用率、骨骼特性等方面存在很大差异，因此其对有效磷需要量应该有所不同。而且由于家禽磷的需要量尚不清楚以及饲料原料中磷的含量和利用率差异也非常大，实际生产中通常添加过量的磷以提供安全余量。然而逐渐增加的磷源价格以及人们对环境污染的关注，使得研究肉鸡更接近实际需要的有效磷水平成为必要。关于植酸酶替代磷酸氢钙的研究及应用在畜基金项目：公益性行业科研专项（nyhyzx07-038）和国家肉鸡产业技术体系项目（nycytx-42-G2-01）；作者简介：蒋宗勇(1963-)，男，重庆人，研究员，博导，主要从事单胃动物营养研究，E-mail：[e-mail]；禽上的研究报道很多，但由于植酸酶品种、来源、特性不同其生物学效价差异很大。本试验旨在通过研究日粮中不同非植酸磷和毕赤酵母基因工程菌植酸酶水平对43-63日岭南黄羽肉鸡生长性能和胫骨特性的影响，确定43-63日龄岭南黄羽肉鸡非植酸磷（NPP）营养需要量和植酸酶的磷当量值，为黄羽肉鸡日粮的科学配制和植酸酶在生产中的实际应用提供科学依据。1试验材料与方法1.1试验材料植酸酶A（PHYA）是以黑曲霉（A.nigerNRRL3135株）的植酸酶基因序列为模板，根据巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）对密码子的偏爱性，设计出适合在Pichiapastoris中表达的植酸酶基因序列phyA-as并通过人工合成方式克隆出植酸酶基因，通过基因重组技术获得巴斯德毕赤酵母基因工程菌（CCTCCNO：M200005），再经过高密度培养、诱导表达和喷雾干燥制得，植酸酶活性达到5346U/g。植酸酶B（PHYB）是一种生产上常用的美国进口植酸酶。1.2试验动物与分组设计试验选用1320只健康、发育良好的43日龄快大型岭南黄羽肉公鸡作为试验鸡，采用单因子随机分组设计，根据体重随机分为11个处理，每个处理4个重复，每个重复30只。1.3试验日粮以玉米、豆粕为基础日粮，根据黄羽肉鸡的营养、生理特点，并参考中国鸡饲养标准（2004），根据中国饲料成分表（第15版）科学配制试验日粮。各处理间除日粮磷和植酸酶水平不同外，其余营养水平均相同，以石粉和磷酸氢钙来满足钙的需要量，不同处理间钙水平保持一致。试验所用石粉钙含量经测定为38%，磷酸氢钙中钙、磷含量分别为：23.2%、18%。日粮1为基础日粮，不添加磷酸氢钙和植酸酶，NPP水平为0.08%。向基础日粮中添加不同水平的磷酸氢钙得到日粮2、日粮3、日粮4、日粮5、日粮6、日粮7，其NPP水平分别为：0.15%、0.22%、0.29%、0.36%、0.43%、0.50%，向基础日粮中分别添加200U/kg、400U/kg、600U/kg的PHYA得到日粮8、日粮9、日粮10，向基础日粮中添加400U/kg的PHYB得到日粮11，日粮具体配方见表1。表1试验基础日粮组成与营养水平原料组成比例营养水平含量玉米66.12粗蛋白(%)﹡18.05大豆粕27.5钙(%)﹡0.80大豆油2.50总磷(%)﹡0.36石粉2.01非植酸磷(%)﹡0.08食盐0.25赖氨酸(%)0.90蛋氨酸0.10蛋氨酸(%)0.35预混料A1.52蛋+胱氨酸(%)0.64合计100苏氨酸(%)0.72色氨酸(%)0.23禽代谢能(MJ/kg)12.70注：A通过预混料向日粮添加（每千克饲粮含量）：维生素A11000IU/kg、维生素D32420IU/kg、维生素E0.0165g/kg、维生素K30.0044g/kg、维生素B10.0022g/kg、维生素B20.0066g/kg、维生素B60.0044g/kg、维生素B120.022mg/kg、烟酸0.044g/kg、泛酸钙0.0132g/kg、叶酸0.0011g/kg、生物素0.044mg/kg。每个阶段：铜8mg/kg、碘0..35mg/kg、铁80mg/kg、锰60mg/kg、锌40mg/kg、硒0.15mg/kg。标﹡值为实测值。1.4试验动物的饲养管理试验鸡在0-21日龄阶段饲喂NPP水平为0.45%、钙水平为1.0%日粮，22-42日龄阶段日粮NPP水平为0.40%、钙水平为0.9%。试验鸡饲养于封闭式鸡舍，地面平养。试验过程中采用常规的免疫程序进行免疫，试验鸡自由采食、饮水，饲料为粉料，试验期21天。1.5检测指标与方法试验前测定饲料样品中的粗蛋白、水分、钙、总磷、植酸磷含量。试验结束前，停料12个小时称重，统计试验期间各重复鸡饲料消耗量，计算平均日增重、采食量和料重比。试验期间每日记录各组试鸡死亡数和腿病发生情况，试验结束时根据以下公式计算试鸡腿病率和成活率，每个栏中取平均体重鸡2只称重，屠宰，取左侧胫骨用于测定脱脂干骨重、灰分、钙和磷含量。胫骨样品经高压处理去除筋腱烘干后用酒精与苯2：1的混合物浸泡96小时，经105℃烘干至恒重测定脱脂干骨重。经脱脂后的胫骨样品在高温炉中烧得灰分并测定灰分中的钙和磷含量。饲料样品和灰分中的钙含量采用乙二胺四乙酸络合滴定法测定，磷含量用钒钼酸铵法测定。饲料样品中的粗蛋白用FossTecator公司提供的全自动微量凯氏定氮仪2300KjeltecAnalyzer（FossTecato公司）测定。1.6数据统计分析试验处理的显著性检验采用SAS8.2软件的ANOVA程序进行方差分析，平均数用Duncan法进行比较，结果用平均数±标准误表示，p0.05表示差异达到显著水平。回归分析分别利用日增重和灰分为效应指标，以无机磷的添加量为剂量指标，利用SAS8.2软件中的PROCNLIN程序进行三种非线性回归模型的参数估计，参数估计值的搜索用METHOD=DUD（多元正割法或错位法）。三种回归模型分别为：单斜率拐点方程、双斜率拐点方程和一元二次拐点方程。单斜率拐点方程包括两部分，第一部分为斜率不为零的直线方程，第二部分为斜率为零的直线方程，两直线方程相交点为方程的拐点，以R表示。当XR时方程为：Y=L+U（R-X）；当X=R时：方程为Y=L。双斜率拐点方程包括两条斜率不为零的直线方程，两直线方程相交点为方程的拐点，以R表示。当XR时方程为：Y=L+U（R-X）；当X=R时：方程为：Y=L+V（X-R）。一元二次拐点方程包括一条一元二次方程和一条斜率为零的直线方程，两直线方程相交点为方程的拐点，以R表示。当XR时方程为：Y=B0+B1×X+B2×X2，当X=R时：方程为：Y=R+B1×R+B2×R2。方程中：X为NPP添加水平，Y为平均日增重或者胫骨灰分含量，L代表拐点所对应的纵坐标值，U代表X＜R时的斜率，V代表X≥R时的斜率。2试验结果与分析2.1不同NPP、植酸酶水平对43-63日龄黄羽肉鸡生长的影响从表2中可以看出：随NPP水平的上升日增重呈现先增加后降低的趋势，NPP水平为0.36%组日增重达到最大，显著高于对照组、NPP0.15%组及0.22%组（P0.05）。NPP水平高于0.36%时日增重显著下降（P0.05）；采食量随NPP水平的上升与日增重表现出同样的趋势。对照组采食量显著低于各加磷组（P0.05），各加磷组间差异不显著（P0.05）；料重比随NPP添加水平的上升呈现先下降后上升的趋势，料重比在0.36%组最低，显著低于对照组及0.15%组（P0.05），与其它各组间差异不显著（P0.05）。0.36%的NPP水平表现出良好的生长性能。从表3中可以看出：添加植酸酶后日增重和采食量都显著高于对照组（P0.05）。添加酶A的三个水平间600U/kg组日增重最大，但与其它各加酶组间差异不显著（P0.05）。采食量随酶A添加水平的上升而提高，添加600U/kg组采食量显著高于400U/kg组、200U/kg组及酶B400U/kg组（P0.05）；料重比加酶各组都显著低于对照组（P0.05），在酶A600U/kg组达到最低，但各加酶组间差异不显著（P0.05）。表2不同NPP水平对43-63日龄黄羽肉鸡生长性能的影响（X±SE）组别NPP水平0.08%0.15%0.22%0.29%0.36%0.43%0.50%日增重28.5±0.42d33.0±1.73c38.6±0.59b40.9±0.43ab44.9±1.42a39.6±0.62b37.8±1.13b采食量1