动物实验设计

奥扎格雷注射液治疗急性心肌梗死课题来源：自选设计班级：2012级在职研究生设计人员：郭红前T2012044设计日期：2012年10月26日一、实验设计的目的意义：实验设计的目的意义，国内外研究现状，存在的问题，解决问题的思路。目的与意义:复制急性心肌梗死动物模型，观察奥扎格雷注射液的疗效，从而探讨奥扎格雷注射液是否对急性心肌梗死有较好的临床效果，为临床上提供抗血小板注射药治疗急性心肌梗死的新思路。国内外研究现状：急性心肌梗死(AMI)是由冠状动脉供血不足所引起的心肌坏死的临床综合征，AMI发病突然、凶险、病死率高，抢救治疗必须争分夺秒。急性心肌梗死常导致冠心病患者心律失常及心脏骤停，严重可导致患者猝死[1]。患者由于冠状动脉病变，动脉内粥样斑块破裂，使冠状动脉供血不足而导致心肌急性坏死。其治疗原则是尽快抢救恢复心肌的血液灌注和及时、充分开通闭塞的血管，以挽救存活及濒死心肌[2]；防止梗死扩大或缩小心肌缺血范围，限制和缩小梗死面积可以最大限度地减少心脏泵功能衰竭或与其相关的致命性心律失常以及心脏破裂的发生，保护和维持心脏功能；及时处理并发症[3]；是急性心肌梗死治疗的重要目标之一。而治疗时如何使急性闭塞的梗死相关血管尽早恢复前向血流，实现早期再灌注(早期血运重建)是达到上述目标的关键。近年来，对AMI的治疗进展较快，而且对改善AMI的预后起到了积极重要的作用，取得了很好的效果，AMI的治疗方法包括溶栓治疗、经皮冠状动脉介入(PCI)、冠状动脉搭桥术(CABG)、心肌干细胞移植等。[4]奥扎格雷为血栓烷（TX）合酶抑制剂，能阻碍前列腺素H2（PGH2）生成血栓烷A2（TXA2），促使血小板所衍生的PGH2转向内皮细胞。内皮细胞用以合成PGI2，从而改善TXA2与前列腺素PGI2的平衡异常。理论上能抑制血小板的聚集和扩张血管作用。主要用于急性脑梗塞的治疗。冠状动脉粥样斑块的不稳定性决定了不稳定性心绞痛的发生机制，脂质斑块的破裂是由纤维帽变薄和脂质斑块增大，以及炎症的发生，炎性细胞的侵润，血管壁所受的剪切力增大，产生斑块破裂、冠状动脉就可能被纤维蛋白原、血小板聚集物和红细胞集合而堵塞，导致腔内不全性狭窄、阻塞，而形成临床不稳定型心绞痛。由血小板激活释放的TXA2可以诱发冠脉痉挛，加重冠脉狭窄。UAP的血栓大多数是以血小板为主要成分，纤维成分少的“白血栓”或“灰血栓”[5]，因此，抗血小板凝集的治疗意义非常大。目前普遍认为体内血栓调节机制是由前列腺素G2(PGG2)和前列腺素H2(PGH2)在凝血恶烷A2(TXA2)合成酶的作用下形成TXA2，从而促使血小板聚集而形成血栓；另一方面PGG2和PGH2又在前列环素I2合成酶作用下可转化成前列环素I2(PGI2)，抑制血栓的形成，促使血栓溶解。奥扎格雷钠为凝血恶烷A2(TXA2)合成酶抑制剂，能选择性抑制TXA2合成酶，同时也能增强PGI2合成酶达到消除血栓[6]。存在的问题：目前临床上奥扎格雷注射液主要用于治疗急性脑梗塞，蛛网膜下腔出血脑血管痉挛等疾病。但在急性心肌梗死方面治疗应用经验不足。解决问题的思路：复制急性心肌梗死的动物模型。对急性心肌梗死动物给予奥扎格雷注射药，观察治疗疗效。参考文献：[1]项建立．急性心肌梗死的治疗进展[J]．医学理论与实践，2009，22(8)：907—9l1．[2]贾浩．急性心肌梗死不同时期溶栓的疗效观察和分析[J]．临床医学，2006，26(10)：66—67．[3]叶任高，陆再英．内科学．人民卫生出版社，2006：283-297．[4]中华医学会心血管病学分会．急性心肌梗死诊断和治疗指南．中华心血管病杂志，2001，29：713-714．[5]李元玖，李正信,张颖，等.降纤酶抗心绞痛作用与血浆纤维蛋白原及纤溶系统关系的研究［J］.临床内科杂志,2004,10：698.[6]吕红星，刘鸿雁，张国莉，等.奥扎格雷钠治疗脑血栓形成［J］.中国新药与临床杂志，1999,18(1):57.二、实验设计方案（实验设计目标,拟解决的主要问题,实验动物设计,实验专业设计，实验统计设计,实验方法设计，可行性分析,预期结果，实验设计工作时间安排）。（一）实验设计目标，拟解决的关键问题设计目标：研究奥扎格雷注射药能否用于急性心肌梗死，观察其对急性心肌梗死时堵塞血管有无再通作用及侧枝循环建立有无帮助。拟解决的关键问题：sD大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，经口人工呼吸，开胸结扎左冠状动脉前降支，制备动物试验性急性心肌梗死模型。对试验性急性心肌梗死模型进行分组与实验结果分析。（二）实验设计1、实验动物设计实验动物的描述：健康雄性SD大鼠100只，SPF级，4～6周龄，体重17～l8g。实验动物遗传背景：此动物为近交系动物，近交代数为10，品系数为12。实验动物的微生物背景：要求对毛滴虫，鞭毛虫，金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌，乙型溶血性链球菌，绿脓杆菌，小鼠肺炎病毒，小鼠脑脊髓炎病毒，做国家标准性检测。我们选用200—250g左右的雄性SD大鼠作为实验动物，有以下几点理由：(1）、SD大鼠易得到，价格适中且容易饲养，在科研中已被广泛利用。(2）、SD大鼠的冠状动脉左前支易找到，使得冠状动脉结扎术的难度减小，且术后存活率高身体机能恢复较快。2、实验专业设计选用雄性SD大鼠作为实验动物，分别给予奥扎格雷注射液观察对实验性急性心肌梗死治疗作用。观察心电图、心肌组织HE染色、梗死面积、梗死区室壁厚度变化、心室肌质量／体重、颈总动脉收缩压(SBP)和舒张压(DBP)，向前推送导管至左心室测量左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)等参数。[9]3、实验统计设计（1）随机：先将试验大鼠称重，然后先按体重每10g为一个重量级，从小到大排列为2个组，随后用龙胆紫和苦味酸将大鼠进行标记，龙胆紫表示个位，苦味酸表示十位，从大鼠的左爪开始标记，记为1，随后依次将左侧腹部，左后爪，右前爪，右侧腹部，右后爪，颈部，背部，尾部记为2，3，4，5，6，7，8，9。随后得到大鼠1至80的编号，再在随机数表中查询数字并分组。（2）对照：本组实验做了空白对照和实验对照，在前面的专业设计里已经提及。（3）重复：本实验采用的是每实验小组有20只SD大鼠，具有一定的重复性。（4）统计数据收集：本实验搜集计量资料，初步确定对各组实验数据的比较分为实验值和基础值比较。(5）统计数据分析本实验采用计量资料来测定各种指标的数值，除了心电图外所有数据均采用平均数±标准差(±s)表示，两组间实验数据比较行完全随机单因素方差分析，奥扎格雷注射液组，造模组间行两样本比较t检验，均以0.05作为显著性检验水准。4、实验方法设计实验技术路线SD大鼠模型组治疗组心电图HE染色试验、梗死面积大小、梗死区室壁厚度变化、心室肌质量／体重、SBP、DBP、LVSP、LVEDP、左室内压最大上升和下降速率心电图HE染色试验、梗死面积大小、梗死区室壁厚度变化、心室肌质量／体重、SBP、DBP、LVSP、LVEDP、左室内压最大上升和下降速率不做任何治疗奥扎格雷治疗实验技术方法(1)随机抽样：选正常成年健康重量相近的SD大鼠100只，从造模成功的大鼠中选出80只大鼠按体重由小变大编号后，从随机数字表中查取随机数字，依次抄录于SD大鼠编号。(2)实验编号与分组：先将试验大鼠称重，然后先按体重每10g为一个重量级，从小到大排列为若干个组，随后用龙胆紫和苦味酸将大鼠进行标记，龙胆紫表示个位，苦味酸表示十位，从大鼠的左爪开始标记，记为1，随后依次将左侧腹部，左后爪，右前爪，右侧腹部，右后爪，颈部，背部，尾部记为2，3，4，5，6，7，8，9。随后得到大鼠1至80的编号，再在随机数表中查询数字并分组。(3)实验手术：抓取手术大鼠，观察其是否健康，如果老鼠身体状况有异，应要更换老鼠。然后在电子称上称其重量，并做好记录，根据体重严格计算麻醉剂量，采用胸部注射麻药。大约三分钟左右，大鼠出现站立不稳，醉酒样步态。四肢固定与手术台上，松紧适中，手术过程中注意观察四肢是否出现瘀血，注意按摩。此时，可用大头针刺激大鼠尾巴，如果大鼠的反应不强烈，预示着可以开始手术。首先剪除大鼠前胸区域毛，而后均匀喷洒碘伏溶液于备皮区域。开通人工呼吸，BL一410生物机能实验系统行心电监测，从左胸纵切口分层开胸。(4)模型复制：于胸骨左缘第4肋间用血管弯钳稍用力穿透肋间肌进入胸腔，并迅速沿肋间隙方向撑开血管钳而钝性分离肋间肌;术者用另一血管弯钳垂直肋间隙撑开肋骨，暴露心脏。在肺动脉圆锥和左心耳之间，距左冠状动脉起始2mm处穿5—0号无创伤丝线，结扎该段冠状动脉。结扎后可见左室前壁失去原有光泽，变苍白，并出现搏动减弱，心电监测可见肢体导联R波振幅明显升高，随后出现I、aVL导联ST段明显抬高，证实制作AMI模型成功。术后注射青霉素预防感染。(5)处理措施：1.奥扎格雷注射液：建模成功后即刻注射奥扎格雷注射液0.2mg/100g，以后每隔24h按上述剂量注射一次。[10]2.损伤组：建模成功后不给予任何治疗措施。(6)取材：将压力传感器与BL-410生物信号采集系统连接，测量并记录所需要的各项指标。经股静脉注入10%KCl2ml，使心脏停搏于舒张期，迅速取出心脏，用PBS液洗去血液，滤纸吸净水分后用电子天平(精确到0.1mg)分别称取左、右心室实际重量(LVAW、RVAW)，计算其与体质量(BW)的比值，得到左、右心室相对重量(LVRW、RVRW)。将心脏从心尖到心底沿长轴横切4等分，用4%多聚甲醛固定24h后分别石蜡包埋。各取一张5μm的病理切片作HE染色。[11]用HPIAS彩色病理图文分析系统测量每张切片的心内膜缘总长及心梗部位心内膜缘长度，计算梗死面积。(7)指标检测：①心电图：于术后0h、24h、1w、2w、3w、4w，分别观察其心电图的变化。②HE染色切片观察：在24h、1w、2w、3w、4w，时分别从5组中每组随机取出4只大鼠处死，并迅速取出心脏，PBS液洗去血液。用甲4%多聚甲醛固定24h后分别石蜡包埋。各取一张5μm的病理切片作HE染色并观察。③血流动力学检查（SBP、DBP、LVSP、LVEDP、左室内压最大上升和下降速率)在24h、1w、2w、3w、4w，时分别从5组中每组随机取出4只大鼠，用3%戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔注射麻醉，气管切开插管，保持呼吸道通畅。分离右侧颈总动脉，插入2F聚乙烯导管，0.3%肝素生理盐水抗凝，将压力传感器与BL-410生物信号采集与处理系统连接，测量并记录颈总动脉收缩压(SBP)和舒张压(DBP)，向前推送导管至左心室测量左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)等参数。测定SBP、DBP、LVSP、LVEDP、左室内压最大上升和下降速率的意义：这些指标能直接反应出心脏的恢复情况，从而了解到各种处理措施对大鼠恢复心脏功能的作用。○4梗死面积大小、梗死区室壁厚度变化、心室肌质量／体重指标的测定：在24h、1w、2w、3w、4w，时分别从2组中每组随机取出4只大鼠，处死大鼠后用滤纸洗净，用电子天平分别称取左、右心室实际重量(LVAW、RVAW)，计算其与体质量(BW)的比值，得到左、右心室相对重量(LVRW、RVRW)。将心脏从心尖到心底沿长轴横切4等分，用尺子测量心室的厚度，并用4%多聚甲醛固定24h后分别石蜡包埋。用HPIAS彩色病理图文分析系统测量每张切片的心内膜缘总长及心梗部位心内膜缘长度，计算梗死面积。[12]从梗死面积的变化情况可以知道该处理措施是否减小了梗死面积，从梗死区室壁的厚度变化我们可以知道各种药物处理是否对心室壁的重构有影响，从心室肌质量/体重可以知道心肌代偿肥大的程度。（三）可行性分析1、SD大鼠易得到，容易饲养，在科研工作中被广泛利用。2、手术器材、设备、仪器、药品均为实验室常用或易于得到。3、实验药品较便宜，且选用大鼠使实验成本较低。（四）预期效果1、奥扎格雷注射液治疗急性心肌梗死疗效更明显。2、为临