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http://www.hxtb.org化学通报2005年第68卷w135化学发光法检测肿瘤标志物贺艳峰1张家明2郭小英*3朱广华1陆祖宏*3(1东南大学公共卫生学院南京2100092江苏省人民医院河西妇幼保健医院检验科南京2100363东南大学生物科学与医学工程系分子电子学国家重点实验室南京210096)摘要肿瘤标志物作为诊断肿瘤的一项重要指标，其检测对于疾病的治疗与预后具有重要的意义。化学发光法是一种灵敏度非常高的分析方法，现已广泛应用于检测肿瘤标志物的研究中。随着发光试剂与检测仪器的不断进步，化学发光法研究也在不断深入发展，作为检测肿瘤标志物的一种重要方法，将为肿瘤的早期诊断以及愈后的监测发挥更重要的作用。本文从化学发光体系、检测仪器以及高新技术在该领域的应用及产生的影响三个角度，综述了化学发光法用于肿瘤标志物检测的研究进展，对该领域未来的发展进行了展望。关键词化学发光肿瘤标志物TumorMarkersDetectionbyChemiluminescenceHeYanfeng1,ZhangJiaming2,GuoXiaoying*3,ZhuGuanghua1,LuZuhong*3(1CollegeofPublicHealth,SoutheastUniversity,Nanjing210009；2ClinicalLaboratory,ProvincialCenterofWomenandChildren’sHealth-Care,Nanjing2100363StateKeyLaboratoryforBioelectronics,SoutheastUniversity,Nanjing210096)AbstractTumormarkersaremuchimportantsignalsinpatients’diagnosisandprognosisoftumors.Chemiluminescenceisananalyticalmethodofhighsensitivity.Nowadaysithasbeenwidelyusedindetectingtumormarkers.Withthedevelopmentofchemiluminescentreagentsanddetectors,itwillbeanimportantmethodofdetectingtumormarkers,largeinfluencesforearlierdiagnosistumorsandbeaveryimportantmethodinclinicallaboratory.Thepapersummarizedthedevelopmentofchemiluminescencesubstratesystems,thedetectinginstruments,theapplicationandinfluenceofthehightechnologyinthisfield,andthefutureprospectaswell.KeywordsChemiluminescenceassay,Tumormarker肿瘤是一类严重威胁人类生命和健康的恶性疾病，2002年世界卫生组织(WHO)公布全世界每年新增1000万癌症病例，目前世界上死亡人数中有12%死于癌症。因此，WHO指出及早诊断和治疗是对抗癌症的有效手段之一，肿瘤的早期诊断是决定其预后的一个重要因素。肿瘤标志物(Tumormarker，TM)作为一项重要指标，在肿瘤早期诊断当中发挥着越来越重要的作用。TM是由肿瘤组织产生的存在于肿瘤组织本身、或分泌至血液或其他体液、或因肿瘤组织刺激由宿主细胞产生的而含量明显高于正常参考值的一类物质[1]。TM在肿瘤的治疗监测和预后方面具有一定的应用价值。目前发现的肿瘤标志物已经有一百多种[2]，由于大多数情况下体内肿瘤标志物的贺艳峰男，27岁，硕士生，现从事生物分子的化学法分析检测。*联系人，E-mail:[e-mail]，[e-mail]国家自然科学基金(60121101和60223002)及国家863高新技术(2002AA2Z2041和2004AA302070)资助项目2005-05-08收稿，2005-06-23接受http://www.hxtb.org化学通报2005年第68卷w1352含量都非常低，一般的检测方法很难对其进行精确的定量。过去对肿瘤标志物的检测主要用放射免疫分析法[3]，这种方法存在诸多缺点，如操作复杂、测定结果不稳定、试剂保存时间短、放射性污染、仪器昂贵等。因此，亟待发展一种新的检测方法对血液中TM进行精确的定量分析。化学发光法检测正好适应了这种需要。1不同化学发光体系在肿瘤标志物检测中的应用与其它分析方法相比，化学发光法具有检测灵敏度高、线性范围宽、检测仪器简单等诸多优点，既没有前面所述的放射免疫分析法的诸多缺点，又没有荧光免疫分析法实验仪器价格昂贵、需要专业人员进行操作、试剂保存要求严格、容易受到样品中自然荧光的干扰等缺点；与分光光度酶免疫测定法相比，其线性范围更宽[4]。早期的化学发光法主要用于对金属元素的测定，上世纪70年代末，Halmann和Vela[5]首先把化学发光(CL)与酶免疫反应结合起来，建立了化学发光酶免疫分析法(CLIA)。目前，它已成为生命科学研究中的一个重要的分析手段，广泛应用于核酸分析[6]、蛋白质分析[7]、免疫分析[8]、进行基因分析[9]、发光成像分析[10]、细胞分析[11]等方面。如Xu等[6]采用自组装技术将DNA探针固定在金电极表面，进行DNA互补序列杂交，然后与抗生物素-碱性磷酸酯酶偶合，利用磷酸酯酶催化底物产生化学发光进行DNA片断分析，线性范围宽达5个数量级，检出限为15pmol/L。目前为止化学发光免疫测定在临床上应用主要有两类：一是以鲁米诺(Luminal,氨基苯二酰一肼)及其衍生物[12]为代表的传统发光试剂，将ABEI或吖啶酯标记在抗体上与待测抗原结合；然后，加入催化剂或增敏剂根据发光强度的大小对检测物进行定量；另一是用辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)[13,14]对抗体进行标记，然后加入待测抗原使之结合，HRP和ALP可以催化发光底物(如AMPPD等)，产生发光信号。前者属于发光试剂直接与检测物反应而发光；而后者则是HRP或ALP催化发光底物使之分解而产生发光信号。Sasamoto等[14]报道了利用CLIA法，采用ALP标记抗体对血清中hCG进行了测定；Xue等[15]描述了一种采用ABEI标记抗AFP抗体，在氧化电极的作用下产生电致化学发光，由于抗原与抗体结合后会使发光强度降低，利用此原理对体内的AFP进行了检测，检测限达0.01ng/mL，线性范围为0.01～30ng/mL。NHNHNH2OOOH-NHN-NH2OO氧化剂OH-COO-COO-NH2*+N2COO-COO-NH2+hυluminol图1鲁米诺参与的化学发光的原理Fig.1Principleofchemiluminescenceinducedbyluminol氨基苯二酰肼类参与的CL反应需要催化剂(如过氧化物酶，POD)的参与，底物主要是鲁米诺、异鲁米诺衍生物，此类物质价格便宜，基本实现了国产化，是当前在临床应用最广的一类发光试http://www.hxtb.org化学通报2005年第68卷w1353剂，其发光原理如图1所示。章竹君[7]利用辣根过氧化酶(HRP)催化H2O2氧化曙红的反应和HRP催化H2O2与发光剂鲁米诺的化学发光反应相耦合，测定血液中甲胎蛋白的含量，线性范围为0.10～100ng/mL，该法比ELISA法灵敏度高10倍，且两法具有较好的相关性。吖啶酯参与CL的这类化学反应不需要催化剂的参与，在过氧化氢的稀碱溶液中即能发光，其原理如图2所示。庄惠生等[16]采用自己设计的一种新的合成吖啶酯的方法，并利用自制的双吖啶发光标识物[17]10,10'-二甲基3,3'-二磺酸基-9,9'-双吖啶(简称DMDSBA)标识抗癌胚抗原(CEA)抗体，成功地对CEA进行了检测，线性范围为1.0～150.0ng/mL，检测限为0.53ng/mL，结果与放射免疫法相关性良好，相关系数为0.9958。刘农乐[8]利用吖啶酯标记抗体检测正常女性、孕妇及膀胱癌病人尿中的人表皮生长因子(hEGF)的含量，灵敏度可达2ng/mL，他们发现孕妇尿中的含量明显高于正常女性，膀胱癌患者尿中hEGF含量明显低于正常人。NNCH3CH3OH-H2O2NNCH3CH3OO2N*CH3O++图2吖啶酯参与的化学发光的原理Fig.2Principleofchemiluminescenceinducedbyacridineester碱性磷酸酶(ALP)参与的CL是利用发光底物AMPPD[18]在碱性磷酸酶的作用下分解成不稳定的dioxetane而发光。AMPPD是一种新型的化学发光剂，属二氧杂环丁烷类，性能十分稳定，5℃下保存的固体AMPPD几乎不分解。在溶液中AMPPD的磷酸酯键很稳定，非酶催化的水解非常慢，在0.05mol/L碳酸缓冲液(pH=12,5℃)中的分解半衰期为74y[19]，几乎无试剂本身的发光背景，是一种近乎理想的发光试剂。AMPPD在碱性磷酸酶的催化下分解而发光，原理如图3所示，30min后发光达到稳定并可持续一周没有明显减弱。这种试剂受到国外知识产权的限制，完全依赖进口，价格较高，但由于该试剂具有其他试剂所没有的优点，因此现在已经被应用于临床一些肿瘤标志物的检测当中。OOOCH3OPO3碱性磷酸酶PO33+OOOCH3O-O+O-OCH3O*光图3AMPPD参与的化学发光的原理Fig.3PrincipleofchemiluminescenceinducedbyAMPPDhttp://www.hxtb.org化学通报2005年第68卷w1354从1982年第一篇化学发光用于肿瘤标志物检测的文献开始到2005年4月的24年间出现了大量的文献[20~83]，纵观这些文献，化学发光检测肿瘤标志物的研究体现出以下一些特点：(1)化学发光体系不断多样化，新发光体系不断涌现，如luminol-Ab[20]，吖啶酯-H2O2发光体系[21]，MECLIA[22]，Ru(bpy)32+-NHS-ECL体系检测[23]、AMPPD-ALP-Ab[24]，DMDSBA-H2O2[16]化学发光体系等发光体系的出现并成功应用于许多肿瘤标志物的检测中。早期化学发光法检测肿瘤标志物主要是利用鲁米诺和过氧化物酶系统，如1982年Pronovost等就利用异鲁米诺-过氧化物酶发光系统对AFP[25]进行了检测，1986年Haggart等[26]采用以Luminol-H2O2-对碘苯酚的增强化学发光酶免疫法，对CEA进行了检测。目前利用化学发光法检测肿瘤标志物的研究虽然大多停留在对一些传统发光试剂的研究上，但最近有一些科研工作者开始了对一些性能优越的新型发光底物的应用研究，并取得了一些研究成果，已经被广泛应用于脂质、激素、DNA[27]、RNA[28]、肿瘤标志物的检测中。如曾常茜等[29]将化学发光免疫测定方法应用于血清CEA测定，利用免疫学原理使之形成ABEI-CEA-McAb结合物，加入增敏剂和催化剂Hemin和H2O2，最后测定光信号强弱，从而对CEA进行定量。最近，许多公司都推出一些高效的发光底物，如Pierce公司推出的Supersignal®系列Western化学发光底物系统，这些发光底物产品在核酸检测中得到了广泛的应用，其检测限最低可达10-15g。Lumigen公司推出的LumigenAPS-5新型化学发光底物可以被ALP催化分解产生光信号，其对ALP的检测限可达10-19mol，是一种优良的新型发光底物，它现在已经作为发光探针被用于基因芯片的研究中[30]；该公司推出的LumigenPS-3也是一种新型的发光底物，它可以被HRP催化分解产生发光信号，在免疫检测分析当中得到一定的应