搜索
1．2基因工程的基本操作程序学习导航1.掌握目的基因获取的常见方法。[难点]2.学会基因表达载体构建的方法和要求。[重点]3.理解目的基因导入受体细胞的具体过程。4.掌握目的基因检测与鉴定的具体操作。[要点]新知初探思维启动一、目的基因的获取1..从基因文库中获取目的基因将含有某种生物的不同______的DNA片段导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物不同的基因，称为基因文库。基因基因文库包括两种：________文库，即包含一种生物所有基因的文库；__________文库,即只包含一种生物的一部分基因的文库，如cDNA文库。2.利用PCR技术扩增目的基因(1)PCR的含义：是一项在生物______复制特定DNA片段的核酸合成技术。(2)目的：短时间内大量扩增目的基因。(3)原理：________________。基因组部分基因体外DNA双链复制(4)过程：第一步：加热至90～95℃,_______________;第二步：冷却至_________℃，引物与两条单链DNA相应互补序列结合；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶(Taq酶)从引物起始进行互补链的合成。如此重复循环多次。(5)特点：指数形式扩增。DNA解链为单链55～60想一想1．PCR过程中，需要解旋酶吗？所需要的DNA聚合酶应具有什么特点？【提示】PCR过程中，DNA双链解开是在高温下完成的，不需要解旋酶；由于PCR过程温度较高，所以需要能耐高温的DNA聚合酶。3.用化学方法人工合成如果基因比较___,核苷酸序列又已知,也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。二、基因表达载体的构建基因表达载体的组成：必须有启动子、____________、终止子以及标记基因等。小目的基因三、将目的基因导入受体细胞1..转化___________进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。2.常用的导入方法(1)将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是________转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法。目的基因农杆菌(2)将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是__________技术。此方法的受体细胞多是_________。(3)将目的基因导入微生物细胞的方法：①用_______处理细胞，使细胞处于能吸收周围环境中DNA分子的生物状态,这种细胞称为________细胞。②将重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合，在一定温度下完成转化过程。显微注射受精卵Ca2＋感受态想一想2．从细胞器的功能上分析，若通过基因工程生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？【提示】不可以，糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，而内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含有这两种细胞器。四、目的基因的检测与鉴定1..首先要检测转基因生物的DNA上是否插入了_________,方法是采用______________技术。2.其次还要检测目的基因是否转录出了________,方法是采用__________技术。目的基因DNA分子杂交mRNA分子杂交3.最后检测目的基因是否翻译成________,从分子水平检测的方法是采用______________技术。4.有时还需进行___________水平的鉴定。如需要做抗虫或抗病的接种实验等。蛋白质抗原—抗体杂交个体生物学要点突破讲练互动要点一“目的基因的获取”应注意的几个问题1..PCR技术与DNA复制的比较比较项目DNA复制PCR技术区别解旋方式解旋酶催化DNA在高温下变性解旋场所细胞内(主要在细胞核内)细胞外(主要在PCR扩增仪中)比较项目DNA复制PCR技术区别酶DNA解旋酶、DNA聚合酶耐热的DNA聚合酶温度细胞内温和条件控制温度，需90℃～95℃高温结果合成DNA分子合成DNA片段或基因联系(1)模板：均需要脱氧核苷酸双链作为模板(2)原料：均为四种脱氧核苷酸(3)酶：均需DNA聚合酶(4)引物：都需要引物，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸2.人工合成目的基因常用方法人工合成目的基因的方法主要有两种。(1)反转录法，主要用于相对分子质量较大而又不知其序列的基因，它是以目的基因的mRNA为模板，借助反转录酶合成碱基互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，其过程如下：(2)化学合成法，即依照某一蛋白质的氨基酸序列，通过密码子推算出其基因序列，然后直接合成目的基因，其过程如下：(2012·青岛市高二期末)1970年，科学家证实了RNA病毒能依赖RNA合成DNA的过程，并发现了催化此过程的酶。下面为形成cDNA的过程和PCR扩增过程示意图。请根据图解回答下列问题：例1(1)催化①过程的酶是________；核酸酶H的作用是________。(2)③过程也称为DNA的变性，此过程在温度高达90～95℃时才能完成，说明DNA分子具有________性。(3)由图中信息分析可知，催化②⑤过程的酶都是______________，两者在作用特性上的区别是________________________________________________________________________。(4)如果RNA单链中有碱基100个，其中A占25%，U占15%，则通过该过程合成的一个双链DNA片段中有胞嘧啶________个。【解析】根据图示可以看出，该过程是RNA在逆转录酶的催化作用下形成cDNA(负链DNA)，构成RNA—DNA中间体。中间体中的RNA再经过RNA酶H水解，而以剩下的负链DNA复制成双链DNA。①过程是由RNA合成DNA的过程，需要逆转录酶进行催化。②过程是以单链DNA复制获得双链DNA的过程需要DNA聚合酶催化。⑤属于双链DNA复制的过程，需要DNA聚合酶催化。⑤过程在70～75℃环境下进行，所需要的酶能够耐高温。【答案】(1)反转录酶(或逆转录酶)分解RNA(2)稳定(3)DNA聚合酶催化⑤过程的酶耐高温(4)60互动探究(1)上述过程中需要限制酶和DNA连接酶吗？(2)由mRNA逆转录形成的DNA具有启动子吗?【提示】(1)不需要。(2)无。【探规寻律】(1)PCR技术不需要解旋酶，但需利用90～95℃高温使DNA分子解旋。(2)PCR技术的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便根据这一序列合成引物。(3)PCR技术需要耐高温的DNA聚合酶要点二基因表达载体的构建1.构建基因表达载体的目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。2.基因表达载体的构建(1)启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端。它是RNA聚合酶识别和结合的部位，可驱动基因转录。(2)目的基因：编码相关蛋白质，形成基因工程产品或产生新的生物性状。(3)终止子：一段有特殊结构的DNA短片段,位于基因的尾端，作用是使转录在所需要的地方停止。(4)标记基因：一般为抗生素抗性基因或荧光基因等，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因(目的基因是否导入成功)。3.基因表达载体应具备的条件(1)对受体细胞无害，不影响受体细胞的正常生理活动；(2)能自我复制，能通过复制进行基因扩增；(3)具有标记基因，以便于鉴定目的基因是否进入受体细胞；(4)重组DNA大小应适合，以方便操作。特别提醒(1)用同一种限制酶切割质粒和含目的基因的DNA分子的目的是产生相同的黏性末端，便于两者完成拼接。(2)终止子与终止密码子的区别①终止子是DNA分子上决定转录停止的一段DNA序列，其组成单位是脱氧核苷酸；②终止密码子是指mRNA分子上决定翻译停止的三个相邻碱基，其组成单位是核糖核苷酸。(2012·南师大附中高二检测)如图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tetR为四环素抗性基因,P为启动子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别含有包括EcoRⅠ、BamHⅠ在内的多种酶的酶切位点。例2(1)将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRⅠ酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有________________、________________、________________三种。若要从这些连接物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行____________________________________________________________。(2)用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是________。(3)目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是________，其合成的产物是________________________________________________________________________。(4)在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接,酶切时应选用的酶是________。【答案】(1)目的基因—载体连接物载体—载体连接物目的基因—目的基因连接物分离纯化(2)载体—载体连接物(3)启动子mRNA(4)EcoRⅠ和BamHⅠ(只答一种酶不可)【误区警示】(1)切割质粒和目的基因的限制酶一般是同一种酶，以获得互补的末端，利于重组质粒的构建。(2)目的基因的首端和尾端需加上启动子和终止子。要点三将目的基因导入受体细胞不同受体细胞的常用导入方法受体细胞植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法显微注射技术Ca2＋处理法受体细胞体细胞受精卵原核细胞受体细胞植物细胞动物细胞微生物细胞转化过程以农杆菌转化法为例将目的基因插入Ti质粒的TDNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取受精卵→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→基因表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子特别提醒(1)完成基因表达载体的构建，需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶。(2)Ca2＋(或CaCl2溶液)对微生物细胞的作用是增加细胞壁的通透性。(3)目的基因能否在植株细胞内稳定保存并表达的关键是目的基因是否插入到受体细胞染色体DNA上(利用的原理是基因重组)。科学家通过基因工程的方法，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内，并成功实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉。其过程大致如图所示，请分析回答：例3(1)Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有TDNA，把目的基因插入Ti质粒的TDNA是利用TDNA__________________________________________________________________________________________的特点。(2)Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内并成功实现表达的过程，在基因工程中称为________________。(3)将目的基因导入受体细胞的方法有很多种,该题中涉及的是________________。(4)目的基因能否在棉株内稳定遗传的关键是__________________。【解析】本题以抗虫棉的培育过程为背景,考查了运用基因工程技术生产转基因作物的步骤、方法。(1)Ti质粒的最大优点是能将目的基因导入到受体细胞的染色体DNA中，从而使目的基因在棉花体内稳定维持和表达。(2)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。(3)将目的基因导入植物细胞的方法很多，以农杆菌中的Ti质粒为目的基因载体的称为农杆菌转化法。(4)目的基因能否在真核生物中稳定遗传的关键是转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因。【答案】(1)可转移至受体细胞并且整合到受体细胞染色体DNA上(2)转化(3)农杆菌转化法(4)目的基因是否插入到受体细胞