作物基因工程育种研究进展与展望

作物基因工程育种研究进展与展望Thestudydevelopmentofgenesbreedingtechnologyoncrop曾兴权韦泽秀ZengxingquanWeizexiu(西藏自治区农牧科学院农业研究所·西藏拉萨·850032)[摘要]本文综述了作物基因工程育种的主要内容、应用,着重探讨了其技术体系及其在农作物的最新研究进展;并展望了基因工程在西藏作物育种中的发展前景。关键词作物基因工程育种研究进展前景基因工程育种(转基因育种)研究始于20世纪70年代。在以基因突变和有性杂交研究的基础上,拓宽了植物可利用的基因库。采用分子生物学和基因工程技术将外源基因有目的、有计划地插入、整合到事先准备好的受体作物基因组中,使其在受体中得以表达和遗传,从而使受体植物获得新的性状,培育出新的优良品种。植物转基因工程技术无疑已成为当今作物遗传育种、改良品种体系的重要途径之一,主要集中在性状改良、增加抗性等方面,其研究成果和应用前景倍受重视。1、基因工程育种的技术体系1.1构建嵌合基因就基因的结构而言,基因的表达调控是依靠其本身的调节序列(如启动子、终止子)而不是其编码序列。要将一个外源基因整合到受体植物中并高表达,无论组成型还是特异型,最关键的是需要一个强启动子序列。最早使用的组成型启动子是烟草花叶病毒(TMV),现在多采用一些新发现的组成型强启动子,其中使用更广泛的是Ubiquitin1启动子。特异性启动子则根据其表达部位的不同而不同。终止子大多数都采用来自胭脂碱合成酶基因(nos)的终止子(frost)。在构建嵌合基因时,除启动子、目标基因和终止子外,还要加入选择标记基因和报告基因。1.2转化载体的选择在运用DNA直接进行转化时,不需要构建特殊的载体,可直接用质粒进行转化。在用农秆菌介导法进行遗传转化时,则需构建特殊的载体,以适应农秆菌将T—DNA导入寄主基因组。最常用的是Ti质粒。1.3选择转化外植体如水稻转基因研究中常用的转化外植体有原生质体、愈伤组织(或胚性悬浮细胞)和茎尖等组织或器官。水稻的幼胚、成熟胚、幼穗、花药等愈伤细胞则是理想的转化受体,无论基因枪法还是农杆菌介导法都是如此。1.4常用的基因转移技术1.4.1基因枪法又称微弹法、粒子轰击法等,是利用放电加速的金属粒子携带外源DNA打入植物细胞或组织中进行基因转移的一种方法,1987年由美国康奈尔大学的J.C.Sanford发明。基因枪法的操作对象可以是完整的细胞或组织,突破了基因转移的物种界限,也不必制备原生质体,实验步骤比较简单易行,具有相当广泛的应用范围。1.4.2根癌农杆菌介导法根癌农杆菌中一种环形的Ti质粒上的一段T—DNA可以插入植物基因组引起细胞特性变异这一性质而改造T—DNA,将至瘤基因切除,代之以外源的嵌合基因,从而使外源基因得以表达。自Hiei等首次以Nipponbare胚性愈伤组织为受体,用此法成功获得转基因植株以来,农杆菌介导法在水稻转基因中的地位越来越突出。因为根瘤农杆菌介导法的可重复性好,导入基因拷贝数低,操作简便。1.5转化体的筛选和转基因株的分子鉴定转化体的筛选是加人选择压。选择压的加入时机,也因转化方法和外植体类型的差异不同。过早加人选择压,转化细胞往往来不及恢复生长状态,抗性基因未来得及表达,而被选择性试剂抑制或杀死。过迟加入选择压,未转化的细胞则可能逃避选择,导致出现嵌合现象或假转化体。转基因株的分子鉴定可以通过以下5种方法进行:(1)报告基因的酶法检测,因报告基因实际上是一种指示基因。(2)PCR法检测,即在体外快速扩增目的基因的DNA片段,一般检测所用DNA量少,操作简单,成本低。(3)Southern杂交,它可确定外源基因在植物中的组织结构,如外源DNA的整合位置及拷贝数等。(4)Northern杂交,它是检测基因在转录水平上的表达情况,为研究转基因植株中外源基因表达及调控的重要手段。其主要原理是把变性RNA转移和固定在特定的薄膜上,用特定的DNA探针来检测RNA。(5)Western杂交,它是检测目标基因在翻译水平上的表达情况,能直接显示目标基因在转化体中是否经过转录、翻译,最终合成蛋白质而影响植株的性状表现。它是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异蛋白质检测方法。2　基因工程育种的研究进展基因工程技术作为育种工作的一个突破,拓宽了作物可利用的基因库,按照人们事先计划好的方案引发定向变异已成为现实,给植物育种带来了变革。在以下几方面取得了重要进展。2.1抗虫基因工程育种比利时植物遗传公司的科学家于1987年首次将苏云金芽孢杆菌(Bt)毒蛋白基因导入烟草中,转基因烟草表现出对一龄烟草夜蛾幼虫的抗性。随后,多个实验室或公司将不同株系苏云金芽孢杆菌的不同类型的Bt毒蛋白基因导入棉花、番茄、玉米、马铃薯、水稻等植物中,均表现出不同程度的抗虫性。但是,由于原核生物和真核生物在基因结构、不同密码于使用频率以及表达系统方面存在差异,来自原核生物的B1基因在植物中的表达效率很低。这主要是出于Bt基因在其编码毒性区有多处可能引起转录提前终止的Poly(A)加尾信号序列;在真核生物系统中可能引起转录产物不稳定的KFFrA序列;类似于植物内含子可能引起mRNA剪切的AT富集区;另外该基因古有植物使用频率很低的密码子。针对上述不利因子,美国孟山都公司Prtak等人对&基因进行了改造,使H1杀虫蛋白在转基因棉花中的表达提高了约100倍,大幅度提高了对棉铃虫的抗性。这已成为目前转基因植物最成功的范例之一。其它抗虫基因还包括蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶仰制剂基因、植物外源凝集素基因等,但这些抗虫基因多处在研究阶段,其抗虫性也有待提高。〔1〕。2.2抗病基因工程育种病害是植物产量降低的一个重要原因。产生病害的原因是由于植物对病原菌抗菌机理复杂,因而使相应抗病基因的克隆困难,给植物基因工程抗病菌的研究带来了难度。近年来,对植物病原菌的研究大致有以下几种类型:(1)抗病基因,如抗叶枯病基因Xa21;(2)病程相关蛋白类基因,Lin〔2〕和Datta等〔3〕将从水稻中克隆的Ⅰ类几丁质酶基因Chi11转入籼稻获得转基因植株;(3)解毒酶类基因,如对烟草野火毒素有解毒基因ttr;(4)植保素类基因,如芪合酶基因等。这些基因导入植物后,抗病性明显提高,产量大幅度增加。2.3抗除草剂基因工程育种抗除草剂基因工程育种主要有两条途径:一是修饰除草剂作用的靶蛋白,使其对除草剂不敏感,或促其过量表达以使植物吸收除草剂后仍能正常代谢;二是具有抗草丁膦特性,是在作物中导入了从吸水链霉菌中克隆的抗草丁膦(PPT)基因(bar),能将PPT转化为无毒的乙酰化形式〔4〕。由于bar基因等抗除草剂基因本身亦可作为植物转化过程中的抗性标记,因此许多具有其它改良性状的转基因油料作物同时也拥有杭除草剂特性。2.4抗逆基因工程育种目前已分离出大量与抗逆代谢相关的基因,包括与抗(耐)寒有关的脯氯酸台成酶基因、鱼抗冻蛋白(AFP)基因、拟南芥叶绿体3一磷酸甘油酰基转移酶基因,与抗旱有关的茧蜜糖台成酶基因及一些植物去饱和酶基因等。转基因植物都表现出一定程度的抗逆性。但由于生物的抗逆过程是十分复杂的生理生化程,代谢途径具有多样性和复杂性的特点,涉及的酶很多,且都是多基因控制的,仅解决代谢途径中的某个酶或某个胁迫蛋白,对改善植物的抗逆能力作用甚微。2.5基因工程改良品质、提高产量品质改良主要涉及蛋白质的含量、氨基酸的组成、淀粉和其它多糖化合物以及脂类化台物的组成。如将小麦高分子量谷蛋白亚基(HMW)基因导入小麦,以提高烘烤品质、富含蛋氨酸的转基因烟草、直链淀粉含量降低的转基因水稻、月挂酸含量高达40%的转基因油菜都相继成功,月桂酸是制造表面活性剂的重要原料。而天然的油菜种子中月桂酸的含量并不高。Voelker等〔5〕将编码一种酰基一载体蛋白(acy1—carrierprotein)硫脂酶的cDNA导入油菜,获得了月桂酸含量高达60%的转基因油菜。Knutzon等〔6〕将溶血磷脂酸酰基转移酶基因转化油菜,使转基因油菜种子中月桂酸含量进一步提高。刘巧泉〔7—8〕等利用反义RNA技术将反义waxy基因导入到水稻中,基部分T1代植株种子胚乳的直链淀粉含量下降,有的株系已降至2%以下。由转基因技术获得的糯性性状与其它转基因性状一样,表现为显性遗传,这与一般的糯性变异不同。曹孟良〔9〕等将自我调控叶片衰老系统的嵌合基因PSAG12—IPT转入水稻,结果表明,转基因株的叶绿素含量、光合速率分别显著高于阴性对照,对具早衰现象的水稻延缓叶片衰老后,能促进灌浆,增加籽粒的充实度,从而提高结实率和千粒重。3、作物基因工程育种的展望近20年来,基因工程的发展日新月异,硕果累累。全世界已分离出的目的基因有100多个,获得的转基因植物200多种。基因转化技术的日臻成熟,使育种途径进入一个高新时代。大量转基因作物的研究表明,作物基因工程是在基因水平上改造作物的遗传物质,定向改造了作物遗传性状,扩展了育种范围,打破了物种间的生殖隔离障碍,丰富了基因资源。从而使育种更具有科学性、精确性、目的性、共用性和可操作性。随着分子生物学的发展,反义技术的应用、核酶的发现与应用以及无毒信号基因介导的广谱抗病策略、转座子载体系统介导的基因转化策略等其它新技术的应用,拓宽了作物基因工程技术的视野,进一步有目的地培育出高产、稳产、优质和抗逆能力的作物基因工程的新品种。因而,基因工程必须与常规育种相结合,协调好与农业资源遗传多样性保护之间的关系,使之成为作物改良的重要组成部分。转基因农作物为农业带来巨大效益,但技术复杂,在具体实施过程中还会出现各种问题,诸如转基因沉默、安全性检测〔10〕等,要达到真正意义上的“安全”,还需要科学界和社会的相互理解,基因工程的光明前途,无疑会给高科技农业的发展带来举世瞩目的变化。参考文献[1]曹孟良。转基因植物的研究及其产业化进展[J];湖南农业科学;2000(4),6—8。[2]LinW,AnurathaCS,DattaK,etal。Geneticengineeringofresistancetosheathblight[J];Bio?Technology;1995,13:686～691。[3]DattaK,Koukolikova-NicolaZ,BaisakhN,etal。Agrobacteriunvmediatedengineeringforsheathbligheresistanceofildianricecultivarsfromdifferentecosystems.[J]TheorApplGenet,2000,100:832～839。[4]DeBlockM,DebrouwerD,TenningP　TransformationofBrassicanapusandBrassicaoleraccausingAgrobacteriumtumefaciensandtheexpressionofthebarandneogenesinthetransgenicplant.[J]PlantPhysiol,1989,91:694～701。[5]VoelkerTA,Worrc11AC,Andersonq1,etal.Fattyacidbiosynthesisredirectedtomediumchainsintransgenicoilseedplants[J].Science,1992,257:72—74。[6]KnutzonDS,Lardizaba1KD.CloningofacocontutendosoermcDNAencodingaI-acy-snglycerol-3-phosphateacyltransferasethatacceptsmedium-chain-lengthsubstatrates[J].PlantPhysiol,1995,109:999-1006。[7]刘巧泉,王宗阳,陈秀花等。反义waxy基因转化水稻降低胚乳直链淀粉含量的研究[J];21世纪水稻遗传育种展望·北京:中国农业科技出版社,19