纯位移核磁共振氢谱及其应用纯位移核磁共振氢谱

纯位移核磁共振氢谱及其应用1.纯位移核磁共振氢谱什么是纯位移核磁共振氢谱？要回答这个问题，可以从J-耦合这个概念和我们熟悉的核磁共振1H去耦碳谱入手。J-耦合是指分子中核自旋之间借助成键电子影响各自核磁矩取向的一种间接偶极-偶极耦合，以符号J表示。如果用A和B表示两种相互耦合的核自旋，那么它们之间的J-耦合可以nJAB表示，其中n是A和B之间相隔化学键的数目。图1是乙醇分子中1H和13C之间的耦合示意图（注：17O天然丰度极低且为四极核，它与其他核之间的耦合作用对核磁谱图影响一般忽略不计)。nJAB值大小受核的磁旋比、原子序数、相隔化学键的数目、轨道的杂化、键角、取代基的电负性等因素影响。图1.乙醇分子中1H、13C之间的耦合关系图解。A：甲基氢耦合关系；A：亚甲基氢耦合关系；C：甲基碳耦合关系；D：亚甲基碳耦合关系。在核磁共振谱图中，J-耦合作用会使核自旋在其化学位移处的单峰信号裂分为以其化学位移为中心、左右对称分布的多重峰；对于自旋量子数为1/2的核，如1H、13C、19F、31P等，在一级近似条件下，多重裂分峰数目符合n+1规律（n是指与所讨论的核相耦合的核的数目，注意，这n个核与所讨论的核的耦合作用是相同的）。如图1D所示，以乙醇氘代氯仿溶液中的乙醇分子为例，亚甲基碳与亚甲基氢、甲基氢、羟基氢、甲基碳均有耦合作用，分别为1JCH、2JCH、2JCH、1JCC。理论上，1JCH会使亚甲基碳裂分为三重峰，这组三重峰会因甲基氢2JCH作用而再裂分为四重峰；1JCC耦合效应因13C天然丰度太低（1.07%）即检测灵敏度太低而在碳谱中观察不到；与羟基氢的2JCH耦合效应因存在活泼氢的快速交换反应而消失，所以，乙醇亚甲基碳信号是以其化学位移为中心、左右对称分布的3组四重峰。同理，乙醇甲基碳信号是以其化学位移为中心、左右对称分布的4组三重峰。因此，在乙醇氘代氯仿溶液的不去耦碳谱中（图2蓝色曲线），有以δ18.6为中心、左右对称分布的4组三重峰（即乙醇甲基碳信号）和以化学位移δ58.6为中心、左右对称分布的3组四重峰（即乙醇亚甲基碳信号）；而在1H去耦碳谱（图2红色曲线）中却只有δ18.6和δ58.6两个单峰信号，这是因为消除了1H对13C耦合效应，使JCH引起的多重裂分信号融合成单峰信号。与不去耦碳谱相比，1H去耦碳谱更为简洁且单位采样时间内所得信号的信噪比更好。注：本文中谱图采集所用仪器均为分析测试中心核磁组配有BBFO探头的BrukerAvanceIII500WB谱仪，操作软件为BrukerTopspinVersion3.2。图2.100mM乙醇氘代氯仿溶液的核磁共振碳谱图。蓝色曲线：不去耦碳谱（脉冲序列：zg30；采样时间：2898秒）；红色曲线：1H去耦碳谱（脉冲序列：zgpg30；采样时间：366秒）（脉冲序列代码源自BrukerTopspinVersion3.2）。类似地，如果在氢谱采集过程中消除1H与1H之间的耦合作用，就能得1H去耦氢谱，即纯位移核磁共振氢谱（PureShift1HNMRSpectroscopy），亦称宽带同核去耦核磁共振氢谱。由于消除了nJHH耦合效应，即分子中磁等价质子因邻近质子nJHH耦合作用导致的多重裂分信号融合成一个单峰且单峰所处位置为该质子的化学位移，所以，纯位移核磁共振氢谱是与1H去耦碳谱相似的、只含化学位移信息的谱图。图3.100mM乙醇氘代氯仿溶液的核磁共振氢谱局部图。蓝色：常规氢谱（采样时间：16秒）；红色：纯位移氢谱（采样时间：739秒）。脉冲序列为:蓝色：zg30,红色：reset_psyche_1d（脉冲序列代码源自BrukerTopspinVersion3.2）。如图3所示，乙醇氘代氯仿溶液的纯位移核磁共振氢谱（红色曲线）与去耦碳谱相似，甲基氢和亚甲基氢只在其化学位移处有单峰信号。在常规氢谱中分布可达数十个Hz的多重裂分信号，在纯位移氢谱却只有一个共振信号的宽度（通常在2Hz左右）。因此，与传统氢谱相比，纯位移氢谱分辨率有显著提高，但是单位采样时间内所得信号信噪比显著降低。另外，1JCH耦合效应在常规氢谱中也有体现（见图3顶部蓝色曲线），甲基氢因亚甲基氢耦合裂分产生的三重峰信号被甲基碳再次裂分形成信号根部左右对称的两组矮小的三重峰信号；亚甲基氢因甲基氢耦合裂分产生的四重峰信号被亚甲基碳再次裂分形成信号根部左右对称的两组矮小的四重峰信号；不过，因为13C天然丰度极低，这种多重裂分信号在没有进行13C标记化合物的氢谱中可以忽略不计（见图3中部和底部蓝色曲线）。2.获取纯位移核磁共振氢谱的技术就单位采样时间内所得信号的信噪比来说，纯位移核磁共振氢谱并无优势。但是，随着科学的发展，使用核磁共振技术研究的样品越来越复杂，样品中磁性原子核数目多达数十个甚至上百个，比如糖类、复合物、脂质体、芳香族化合物、低聚糖等这类分子不同局部有相似结构单元的化合物或者化学反应混合物、天然产物粗提物、人体尿样或血样等这类混合物，它们的核磁共振氢谱往往会因nJHH耦合所致的多重裂分造成信号严重重叠而无法为结构解析或定量分析提供有用信息（如图4中δ4.7～5.9处的多重裂分信号）。图4.采用常规氢谱技术和各种去耦技术采集的25mM环孢霉素A氘代苯溶液的核磁共振氢谱局部图。蓝色曲线：常规氢谱；红色曲线：PSYCHE氢谱；绿色曲线：ZS氢谱；紫色曲线：BIRD氢谱。因此，早在1963年，Ernst和Primas就开始探索能同时消除nJHH耦合的方法。经过13年的努力，Ernst团队终于提出了一种通过间接方式获取全去耦氢谱（纯位移核磁共振氢谱）的技术，即利用二维J-分辨谱图的特殊投影消除标量耦合。不过，这种技术与随后几十年中陆续出现的获取全去耦氢谱技术一样，都需要借助于二维实验的间接维、数据处理比较复杂、与传统氢谱相比灵敏度较低，这些缺点限制了它们的应用。当然，多维核磁共振技术的发展和仪器磁场强度的提高，在一定程度上也降低了波谱学家们获取全去耦氢谱的渴求。但是，自2010年起，基于KlausZangger和HeinzSterk的工作，Morris团队在获取纯位移核磁共振氢谱技术研究方面取得了突破性进展，使全去耦氢谱实验变得更加简单、灵敏度更高、实用性更强；而且，他们通过宽带质子去耦技术得到的核磁共振氢谱的分辨率与超高场仪器（至少是3GHz或高于3GHz）所得常规氢谱的理论分辨率相当。而自1945年发现核磁共振现象以来，经过科学家和仪器制造商们近70年的努力，才于2009年诞生一台1GHz商业化的核磁共振波谱仪。已经报道的获取纯位移核磁共振氢谱的方法有很多，目前最受关注的三种方法是：1982年由Garbow等人开创的第一代BIRD技术（BilinearRotationalDecoupling，双线性转动去耦)、2013年由Zangger等人开创的第二代ZS方法（Zangger-Sterk，亦称Slice-selectiveDecoupling，即片层选择性去耦）、和2014年由Morris团队开创的PSYCHE（PureShiftYieldedbyChirpExcitation）同核宽带去耦技术。图4中纯位移氢谱就是使用这三种技术所得谱图。BIRD、ZS、PSYCHE各有优缺点，BIRD只检测与13C键合的质子，如图4所示，使用BIRD技术，环孢霉素A分子中与氮原子键合的质子在δ7.4～8.6处信号就无法被检测；ZS对强耦合体系去耦效果不好；PSYCHE实用性要好过ZS和BIRD，但它必须使用二维采样模式，对仪器软件和硬件配置要求都比较高。3.纯位移核磁共振氢谱的典型应用3.1简化氢谱当样品（如多糖、复合物、脂质体、芳香族化学物、寡聚体、反应混合物等）的一维氢谱太复杂而出现模棱两可的结果、二维实验仍然因信号重叠无法指认时，可以使用纯位移技术简化谱图，以便信号归属和定量分析。例如，Morris团队于2014年报道了他们利用纯位移核磁共振氢谱确定样品的非对映体比例方法。对较简单的样品如橘皮苷，可直接利用它的纯位移氢谱计算非对映体比例；针对较复杂样品如非对映立体选择性反应混合物，对所得纯位移数据进行线性拟合之后也可得到较准确的非对映体比例。3.2代谢组学或天然产物粗提物研究使用高场仪器研究临床生物化学、毒性和药物代谢越来越普遍，但是，灵敏度的增加也提高了检测最低限，使化学噪音和低浓度代谢产物引起的谱图重叠现象更加突出。相比于COSY、SPEC-NMR方法，纯位移技术能更有效地解决这种由化学噪音和低浓度代谢产物引起的信号重叠问题。例如，Keeler等在500MHz的仪器上使用纯位移技术，顺利地把KG1a（AMLcancermodel）细胞粗提物在δ0.5～4.4的重叠信号完全分开。3.3扩散序谱与扩散系数测定核磁共振是最常用的结构鉴定技术，但是，分析混合物时，核磁共振方法受到限制，因为常规核磁共振波谱信号不能把信号分配给各个组分。解决这个问题的方法之一就是使用DOSY，根据各组分自扩散系数（分子尺寸）对信号进行虚拟分离。通过宽带同核去耦消除标量耦合可以克服扩散序谱中信号重叠问题，从而便于提取每一个组分的扩散系数或者准确指认每一个组分的信号。例如，Larive等使用2D-J-DOSY技术，将蔗糖在δ3.5处的三重峰信号从葡萄糖六磷酸盐的多重裂分中提取出来，确保了扩散系数的准确性；Cobas等使用2D同核去耦DOSY技术和标准LED-BPPSTEDOSY实验分析了复杂混合物（蔗糖、β-环糊精和SKF-38393盐酸盐）中各组分的扩散系数，实验结果显示，使用2D同核去耦DOSY实验能更为简单、更为直观地提取各组分的扩散系数；Keeler等人使用antiz-COSY去耦DOSY实验，使奎宁、geraniol和camphene混合物在δ1～2的重叠信号完全分开，便于准确提取每一个组分的扩散系数；Morris等人将BIRD单元用于DOSY实验，使用400MHz仪器就能把2-甲基-1丙醇和2,3-二甲基-2-丁醇在δ0.9～2.7的重叠信号完全分开，使信号归属准确无误；Zangger等人开创的空间选择性去耦DOSY技术，不仅适用于简单小分子混合物（如：有效地把乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、N-甲基单乙醇胺和2-烯丙醇六种醇混合物δ3.5–4.0和δ0.8–1.5的重叠信号完全分开），还适用于复杂的大分子体系[如：在十二肽（KGGEAAEAEAEK，亦称MT3-多肽）、1-肉豆蔻-sn-甘油-3-磷酸胆碱（MHPC）和各种单体氨基酸混合溶液去耦DOSY谱图中，多数信号重叠被消除，MT3-多肽和MHPC形成的复合物MT3-hp、MHPC、各种单体氨基酸分别处于不同的扩散条带]。4．纯位移核磁共振氢谱在所内应用现状PSYCHE和ZS现在都不是商业化脉冲序列，核磁组谱仪的最新版操作软件Topspin(TS3.2pl6)中也没有包括这两个脉冲序列。幸运的是，通过多次与ZS、PSYCHE序列发明人的邮件交流和探讨，目前，我们在核磁室BrukerAvanceIII500WB谱仪上已能顺利运行BIRD、ZS、PSYCHE获取纯位移核磁共振一维氢谱且已经完成某些样品的参数优化工作，在测试服务中也得到了一些不错的结果，如图5所示。今后，核磁组在纯位移技术应用方面还有很多工作要做，首先加强与仪器公司的沟通和交流，优化已有的脉冲序列；其次是保持与ZS、PSYCHE序列发明人的联系，争取将他们最新的纯位移技术应用到我们的仪器上，以扩大我们测试服务的广度和深度。左图右图图5.核磁组利用纯位移核磁共振氢谱为用户服务实例。左图：史一安研究员课题组的化学位移信号归属；右图：江雷研究员课题组的混合物分析。5．结论到目前为止，纯位移技术主要是针对信号重叠严重的氢谱，也有少数应用于13C均匀标记的大分子碳谱去耦。纯位移去耦原理适用于任何有同核耦合的磁性原子核。近几年开发的第二代纯位移技术，如实验设置较简单的BIRD和ZS一维去耦技术以及灵敏度较高的PSYCHE二维去耦技术，将会受到普通核磁共振用户的欢迎。致谢感谢分析测试中心丁丽萍老师对稿件的多次审读和编辑加工