实验六-细菌的生化试验

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实验六细菌的生化试验目的要求1.通过本试验加深对细菌生化反应原理和意义的理解;2.掌握常规细菌生化试验操作方法。操作步骤一、糖类发酵(分解)试验原理:细菌含有分解不同糖(醇、苷)类的酶,因而分解各种糖(醇、苷)类的能力也不一样。有些细菌分解某些糖(醇、苷)产酸(符号:+)、产气(符号:○),培养基由兰变黄(指示剂溴麝香草酚兰由兰遇酸变黄的结果),并有气泡;有些产酸,仅培养基变黄;有些不分解糖类(符号:-),培养基仍为兰色。(一)适用于需氧菌的方法培养基用邓亨氏(Dunham)蛋白胨水溶液(蛋白胨1g,氯化钠0.5g,水100ml,pH7.6按0.5~1%的比例分别加入各种糖),每100ml加入1.2ml的0.2%溴麝香草酚蓝(或用1.6%溴甲酚紫酒精溶液0.1ml)作指示剂。分装于试管(每一个试管事先都加有一枚倒立的小发酵管),10磅高压灭菌10分钟。如在培养基中加入琼脂达0.5~0.7%,则成半固体,可省去倒立的小发酵管。0.2%溴麝香草酚蓝溶液配法:溴麝香草酚蓝0.2g0.1NNaOH5ml蒸馏水95ml方法:从琼脂斜面的纯培养物上,用接种环取少量被检细菌接种于糖发酵管培养基中(如为半固体,应穿刺),在37℃培养,一般观察2~3天,观察时用上述符号标记之。(二)适用于厌氧菌的方法培养基:蛋白胨20g氯化钠5g琼脂1g1.6%溴甲酚紫酒精溶液1ml糖10g硫乙醇酸钠1g蒸馏水1000ml将胨、盐、硫乙醇酸钠、琼脂和水放于烧瓶内,加热使融化,再加入所需的糖,调整pH到7.0,加入指示剂,分装试管,在10磅高压灭菌15分钟后,做成高层。方法将厌氧菌的培养物用穿刺接种法接种于上述培养基的深部,于37℃培养。结果观察同需氧菌。二、V-P试验(二乙酰试验)原理:某些细菌能从葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇(Acetymethylcarbinol)→2,3-丁烯二醇(2,3-bytaylenecylycol),在有碱存在时氧化成二乙酰,后者和胨中的胍基化合物起作用,产生粉红色的化合物。其反应式为:2CH3COCOOH——→CH3COCHOHCH3十2CO2丙酮酸乙酰甲基甲醇CH3CHOHCHOHCH3KOH2HCH3COCOCH32,3-丁烯二醇丁二酮(二乙酰)培养基:含葡萄糖、K2HPO4、蛋白胨各5g,完全溶解于1000ml水中后,分装试管内,间歇灭菌或10磅10分钟灭菌。方法:1.O’Meara’s法试剂:40g氢氧化钾溶于100ml蒸馏水中,加入0.3g肌酐即成。将被检细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养后,于35~37℃培养48小时,于每毫升培养物中加入0.1ml,猛烈摇振混合。2.Baritt’s法试剂:6%α-奈酚酒精溶液为甲液,40%氢氧化钾为乙液。同上法接种培养细菌,于2ml培养液内加入甲液1ml和乙液0.4毫升,摇振混合。试验时强阳性者约于5分钟后,可产生粉红色反应(长时间无反应,置室温过夜),次日不变者为阴性。三、甲基红(M.R.)试验原理:某些细菌在糖代谢过程中生成丙酮酸,有的甚至进一步被分解为甲酸、乙酸、乳酸等,而不是生成V-P试验中的二乙酰,从而使培养基的pH下降至4.5或以下(V-P试验的培养物pH常在4.5以上),故加入甲基红试剂呈红色。本试验常与V-P试验一起使用,因为前者呈阳性的细菌,后者通常为阴性。培养基:同V-P试验培养基。甲基红指示剂:0.1g甲基红溶于300ml95%酒精中,再加入蒸馏水200ml。方法:接种细菌于培养液中,37℃培养2~7天后,于培养物中加入几滴试剂,变红色者为阳性反应。四、淀粉水解试验原理:细菌如产生淀粉酶可将淀粉分解为糖类,在培养基上滴加碘液,可在菌落周围出现透明区。淀粉琼脂培养基:pH7.6的肉浸汤琼脂90ml无菌羊血清(只对不易生长的细菌才加)5ml无菌3%淀粉溶液10ml将琼脂加热融化,冷却到45℃,加入淀粉溶液及羊血清,混匀后,倾注平板。方法:将细菌划线接种于上述平板上,在37℃培养24小时。生长后取出,在菌落处滴加革兰氏碘液少许,观察。结果:培养基呈深蓝色,能水解淀粉的细菌及其菌落周围有透明的环。五、枸橼酸盐利用试验原理:当细菌利用铵盐作为唯一氮源,并利用枸橼酸盐作为唯一碳源时,可在枸橼酸盐培养基上生长,生成碳酸钠,并同时利用铵盐生成氢,使培养基呈碱性。方法1:Simmons氏培养基:柠檬酸钠lgK2HPO4lg硫酸镁0.2g氯化钠5g琼脂(洗过)20gNH4H2PO41g1%溴麝香草酚蓝酒精溶液10ml蒸馏水加至1,000ml调整pH至6.8,15磅15分钟高压灭菌后制成斜面。将上述培养基中的琼脂省去,制成液体培养基,同样可以应用。将被检细菌少量接种到培养基中,37℃培养2~4日,培养基变蓝色者为阳性,不变者为阴性。方法2:Christenten氏培养基:柠檬酸钠5gKH2PO41g葡萄糖0.2g氯化钠5g酚红0.012g半胱氨酸0.1g琼脂15g酵母浸膏0.5g蒸馏水加至1000ml有的配方尚加柠檬酸铁铵0.4g,硫代硫酸钠0.08g。PH不必调整。高压灭菌后做成短厚的斜面。接种时先划线后穿刺,孵育于37℃观察七天。阳性者培养基变红色,阴性者培养基仍为黄色。六、吲哚试验原理:细菌分解蛋白胨中的色氨酸,生成吲哚(靛基质),经与试剂中的对位二甲基氨基苯甲醛作用,生成玫瑰吲哚。培养基:邓亨氏蛋白胨溶液[同(一)]试剂:常用下述两种。1.欧立希氏(Ebrlich′s)吲哚试剂对位二甲基氨基苯甲醛(P-dimethylaminobenzaldehyde)1g纯乙醇95ml浓盐酸20ml先以乙醇溶解试剂,后加盐酸,要避光保存。2.Kovacs试剂对位二甲基氨基苯甲醛5g戊醇(聚异戊醇)75g浓盐酸25ml方法:以接种环接种待试细菌的新鲜斜面培养物于邓亨氏蛋白胨溶液中,37℃培养24~48小时后(可延长4~5天)。于培养液中加入戊醇或二甲苯2~3ml,摇匀,静置片刻后,沿试管壁加入试剂2毫升。在戊醇或二甲苯下面的液体变红色者为阳性反应。也可将一指头大的脱脂棉,滴上两滴欧立希氏试剂,再在同处加滴两滴高硫酸钾(K2S2O4)饱和水溶液,置于含培养液的被检试管中,离液面约半寸,置烧杯内水浴煮沸为止,脱脂棉上出现红色为阳性。此法略繁,但省试剂且准确,因为将试剂加到液体中,吲哚和粪臭素均呈阳性,而用此法,只是吲哚(它能挥发)呈阳性反应。亦可以滤纸片浸湿1%的二甲基苯丙烯甲醛的10%浓HCl溶液,然后以接种环刮取一环琼脂的纯培养物涂布于该滤纸上。细菌涂印周围呈蓝色者为阳性,细菌涂印周围无色泽变化或淡黄色者为阴性。厌氧菌用蛋白胨水蛋白胨20g葡萄糖10g硫乙醇酸钠1gNa2HPO4(无水)2g琼脂1g蒸馏水1000ml加热溶解,调整pH至7.4~7.6,过滤,分装小试管,15磅高压15分钟。七、硫化氢试验原理:有些细菌能分解含硫氨基酸,产生硫化氢(H2S),H2S会使培养基中的醋酸铅或氯化铁形成黑色的硫化铅或硫化铁。方法1:醋酸铅琼脂法培养基:肉汤琼脂100ml10%硫代硫酸钠溶液(新配)2.5ml10%醋酸铅溶液3ml三种成份分别高压灭菌,前二者混合后待凉至60℃,加入醋酸铅溶液,混合均匀,无菌分装试管达5~6cm高,立即浸入冷水中,使冷凝成琼脂高层。方法:用接种针蘸取纯培养物,沿管壁作穿刺,孵育于37℃1~2天后观察,必要时可延长5~7天。培养基变黑色者为阳性。或将细菌培养于肉汤、肝浸汤琼脂斜面或血清葡萄糖琼脂斜面,在试管的棉花塞下方挂一约6.5×0.6cm2的浸蘸饱和醋酸铅溶液(10g醋酸铅溶于50毫升沸蒸馏水中即成)且已干燥的滤纸条,于37℃培养,观察7天,纸条变黑者为阳性结果。方法2:三氯化铁明胶培养基法培养基:硫胨(Thiopeptone)25g明胶120g牛肉膏7.5g氯化钠5g蒸馏水加至1000ml上述成份灭菌后趁热加入5ml灭菌的10%氯化铁溶液。立即以无菌操作分装试管,达5~6cm高,迅速冷凝成高层。方法:穿刺接种,培养于37℃观察7天,培养基变黑色者为阳性。八、硝酸盐还原试验原理:有的细菌能把硝酸盐还原为亚硝酸盐,而亚硝酸盐能和对氨基苯磺酸作用生成对重氮基苯磺酸,且对重氮基苯磺酸与α-萘胺作用能生成红色的化合物N-α-萘胺偶氮苯磺酸,其反应式为:对氨基苯磺酸对重氮基苯磺酸(一)适用于需氧菌的方法培养基:硝酸钾(不含NO2-)0.2g蛋白胨5g蒸馏水1000ml溶解,调节pH至7.4,分装试管。每管约5毫升,15磅高压灭菌15分钟。试剂:甲液对位氨基苯磺酸0.8g5N醋酸溶液100ml乙液α—萘胺0.5g5N醋酸溶液100ml方法:接种细菌后37℃培养4天,沿管壁加入甲液二滴与乙液二滴,当时观察。阳性者立刻呈红色。(二)厌氧菌硝酸盐培养基法培养基:硝酸钾(不含NO2-,化学纯)1g磷酸氢二钠2g葡萄糖1g琼脂1g蛋白胨20g蒸馏水1000ml加热溶解,调整pH至7.2,过滤,分装试管,15磅高压灭菌15分钟。方法:接种后作厌氧培养,试验方法和结果观察同上法,但培养1~2日即可。九、石蕊牛乳试验原理:紫乳培养基中的主要成分为干酪素、乳糖及指示剂等。由于各种细菌对这些成分的作用不同,引起培养基的变化也有不同,观察的主要变化为:产酸:主要从乳糖产生酸,指示剂变酸色(石蕊为红色,溴甲酚紫为黄色)。酸凝或加有产气:产酸,并有牛乳的凝固(pH4.7以下);如有气体形成,则凝块中有裂隙,在魏氏梭菌则呈“暴烈发酵”。凝乳酶产生:很少或无酸产生,牛乳凝固。胨化:部分或大部分牛奶变清亮。产碱:细菌产生蛋白酶可将干酪素分解产生胺或氨,使培养基的pH进一步升高,呈深紫色。培养基:加石蕊的酒精饱和溶液于新鲜脱脂牛奶中,使达浅紫色,分装于小试管,用流动蒸汽灭菌,每天1次,每次1小时,共3天。接种细菌后,培养及观察一周。石蕊酒精溶液的制备:8g石蕊在30ml40%乙醇中研磨,吸出上清液,再如此用乙醇操作两次。加40%乙醇到总量为100ml,并煮沸1分钟。取用上清液,必要时可加几滴1N盐酸使达艳紫色。现在多应用溴甲酚紫代替石蕊,即于100ml脱脂乳中加入1.2ml的1.6%溴甲酚紫的乙醇溶液。方法:将细菌接种于紫乳培养基中,37℃培养1~7天后观察结果,根据细菌的种类不同,可呈现上述一种或几种现象。十、凝固血清液化试验原理:有些细菌产生胞外酶,可使凝固的血清液化,借此鉴别细菌。吕氏血清培养基:1%葡萄糖肉汤(pH7.6)100毫升,无菌羊(牛、猪)血清300ml,混合后,分装于无菌试管,每管约5~7ml,在血清凝固器内摆成斜面,间歇灭菌。第一天,80℃l小时,于37℃过夜;第二天,85℃1小时,于37℃过夜;第三天,90℃1小时,于37℃过夜。弃去有污染的管。方法与结果:将纯培养物在斜面上作划线接种,于37℃培养1周,观察培养基有无液化。十一、肉渣消化试验原理:有些细菌能够产生蛋白酶,消化肉渣。熟肉基:即于pH7.4~7.6的牛肉汤中,于分装试管前,加入半指高的肉渣。液面上加少量凡士林或液体石蜡,15磅高压灭菌30分钟。方法:用无菌毛细玻管或接种环接种细菌后,用蜡笔于培养基的肉渣层上缘划一横线作标记,在37℃培养几天,观察管内肉渣的高度有无变化,即可判定肉渣是否已被部分消化。十二、明胶液化试验原理:有些细菌能产生分泌于细胞外的明胶酶,分解明胶为氨基酸,使半固体的明胶培养基成为液体。培养基:明胶培养基(见附录培养基27)方法1、明胶琼脂平板法可于普通琼脂加入1%明胶倾注平板后,分为四个区,每个区分别划线接种一种被检菌,经24~48小时培养后,于培养基表面注入氯化汞溶液(氯化汞12g,蒸馏水80ml,浓盐酸16ml),如细菌液化明胶,则在菌落周围出现透明带。方法2、将被检菌穿刺接种于明胶培养基,于20℃培养7天,逐日观察明胶液化现象。如室温高,培养基自行溶化时,可与冰箱内放置30分钟,然后取出观察结果,不再凝固时为阳性。十三、尿素酶试验原理:某些细菌能产生尿素酶。尿素酶可分解尿素,产生大量的氨,使培养基的pH值升高,反应式为:OⅡNH2-C-NH2+2H2O尿素酶(NH4)2CO3—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