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PKH26红色荧光细胞连接试剂盒（普通细胞膜标记）产品编号：MINI26，MIDE26和PKH26GL室温保存TECHNICALBULLETIN产品说明PKH26荧光细胞连接试剂盒采用拥有专利的膜标记技术，能够将带有较长脂质尾巴的黄色-橙色荧光染料（PKH26）结合到细胞膜脂质区域上。试剂盒中提供染色过程中所需的溶剂（稀释液C），该溶剂可以可以在染色过程中，增加染料溶解度和染色效率，同时维持细胞活力。稀释液C与哺乳动物细胞等渗，且不含去垢剂或有机溶剂，也不含生理盐水和缓冲盐。根据细胞类型及标记后细胞膜内在的变化，标记后的细胞表面会由均一透亮变得有点状凸起或补丁状。但在生理范围内，PKH26荧光不受pH的影响，每个细胞的荧光强度与染料标记位置无关。PKH26荧光在黄色-橙色区域（图一），可用来标记追踪体内外多种细胞。在细胞毒性分析，荧光蛋白、抗体或DNA染料在该区域发出的紫色、绿色、红色和远红外等，不会与PKH26产生干扰。PKH26最常被用于基于染料稀释增殖的分析的染料稀释应用，包括建立抗原特异性前体frequecies和正常或肿瘤组织中静止或缓慢干细胞或祖细胞的鉴定。同时PKH26也可用于监测外来病毒、血小板和其他纳米颗粒的摄入；干细胞分裂过程中膜的分配；细胞-细胞之间膜的转移；细胞吞噬作用；抗原呈递；粘附；通过间隙连接的信号传递；以及组织切片中的神经元迁移。由于其荧光稳定性较强，PKH26被用于体内细胞追踪研究，特别是在标记的细胞的研究周期超过一周时。图1.PKH26激发和发射光谱试剂组成PKH26染料*（P9691）稀释液C（G8278）MINI261×0.1mL1×10mLMIDI262×0.1mL6×10mLPKH26GL1×0.5mL6×10mL*1×10-3M（溶于乙醇）MINI26试剂盒推荐用于小的或初步试验研究，PKH26GL用于体内实验研究所需设备和试剂（试剂盒未提供）·充分分散的单个悬浮细胞·含血清的组织培养基（完全培养基）·无Ca2+，Mg2+和血清的培养基或者缓冲盐（如Dulbecco’sPBS或Hank’sBSS）·血清，白蛋白或其它组织兼容性蛋白·离心管（4-15mL）·温控离心机（1,000×g）·荧光分析设备（荧光读板机，荧光或共聚焦显微镜，流式细胞仪）·层流罩·血球计数板或细胞计数器·载玻片和盖玻片注意事项和免责说明该产品仅用于科研，不用于制药、家庭或其它用途。请遵照安全数据清单中关于有害及安全操作规范操作。储存/稳定性PKH26乙醇溶液（货号P9691）可室温或冷藏保存。减少蒸发以防止染料浓度升高。保证染料乙醇溶液瓶盖盖紧。该染料避光保存，使用前观察是否有结晶。如出现结晶，37℃热水浴加热，然后超声或震荡直至溶解。稀释液C可室温或冷藏保存。如果冷藏保存，使用前复温至室温（过程，步骤A5和A6）。稀释液C为无菌溶液，不含任何防腐剂和抗生素，其需保持无菌。不要将染料储存于稀释液C中。溶于稀释液C的工作液需现配现用，且配好后需立即使用。操作过程A.一般细胞膜标记亲脂性染料结合到细胞膜上完成标记。染色强度是染料浓度和细胞浓度的函数，与渗透性无关。因此，保证染料添加量不过量非常关键。过标记的细胞将会导致细胞膜完整性缺失和reducedcellrecovery。下列过程可用于体内体外细胞的标记，包括干细胞、淋巴细胞、单核细胞、内皮细胞、神经细胞或者任何其他细胞。体内细胞的标记过程需一定的改进，如血小板的染色，或者选择性标记吞噬细胞。Generalcellmembranelabelingshouldbeperformedpriortomonoclonalantibodystaining.Themembranedyeswillremainstableduringthemonoclonalstainingat4℃；however,cappingofthemonoclonalantibodiesishighlyprobableifthegeneralcellmembranelabelingiscarriedoutatambienttemperaturesubsequenttoantibodylabeling.下述染色过程中细胞浓度和染料浓度代表操作的起始浓度。该浓度被证明适用于多种细胞。使用者需通过评估染色后细胞活率（如，PI染色）、荧光强度、染色均匀度及是否对所研究细胞功能有影响等，根据实验目的，确定最优的染料浓度和细胞浓度。注意1：PKH26染色过程中，不能存在叠氮化物或代谢毒性物。注意2：虽然贴壁细胞也可以染色，但单个悬浮细胞染色均一性更佳。因此用蛋白酶（trypsin/EDTA）将贴壁细胞消化成单个悬浮细胞后再染色效果更佳。下列过程最终体积为2mL，PKH26浓度为2×10-6M，细胞浓度为1×107cells/mL。以下过程均在室温下进行（20-25℃）1.将2×107个细胞于离心管中，用不含血清培养基洗一遍。注意：血清蛋白和脂质会与染料结合，降低与细胞膜结合的染料浓度。最好在用稀释液C重悬细胞染色前（第四步）用无血清培养基或缓冲液洗细胞一次（第一步）。2.400×g离心5分钟。注意：PKH26染料不能直接加到离心沉淀中，这样会造成细胞染色不均一和细胞活力降低。3.离心后，小心吸弃上层清液，剩余上层细胞液体积不超过25μL。注意：为得到可重复的实验结果，在用稀释液C重悬时，减少残留培养基或缓冲液体积非常重要。见参考文献9的注意28。4.加入1mL稀释液C（CatalogNumberG8278），用移液管轻轻吹打混匀，制备2×细胞悬液。不要用振荡器震荡，不要让细胞在稀释液C中保存太长时间。注意：生理盐（physiologicsalts）的存在会使得染料结团并大幅降低染色效率。因此，需确保染色时细胞悬浮于稀释液C中，不含培养基或缓冲盐。5.临染色之前，将4μLPKH26乙醇溶液加入1mL稀释液C中，充分混匀，配制的2×染色液（4×10-6M）。注意1：为减少乙醇对细胞活率的影响，步骤5加入的染料使得步骤6中乙醇最终浓度不能超过1-2%。注意2：如果所需染料最终浓度＜2×10-6M，需用100%乙醇将PKH26稀释于另一单独的容器中，以确保实验结果的可重复性。6.快速将1mL2×细胞悬液（步骤4）加入1mL2×染色液（步骤5）中，立即用移液管混匀。最终细胞浓度为1×107/mL，PKH26浓度为2×10-6M。注意：由于染色瞬间完成，快速将细胞与染料混匀对得到明亮、均匀和可重复的标记结果非常重要。下列措施有助于得到较优的结果：a.不要将PKH26染料直接加入含2×细胞的稀释液C中。b.将2×细胞悬液（步骤4）与2×染色液（步骤5）等体积混合。c.调整2×细胞和2×染料的浓度避免染色体积太小（＜100μL）或太大（＞5mL）。d.用电动移液器快速将细胞和染料混匀。血清移液管混匀速度太慢而使得染色不均匀。Racking和旋涡震荡混匀同样混匀较慢，染色均一性较差。e.分配体积尽量准确，以保证样品与样品之间，实验与实验之间的可重复性。7.混匀后的染色的细胞孵育1-5min。由于染色速度较快，延长孵育时间对实验没有帮助。注意：让细胞在染色液中停留尽量短的时间，同时保证得到理想的染色强度。因为稀释液C缺少生理性盐，过长时间的暴露在稀释液C中会造成某些细胞活力降低。如果不能确定其影响程度，可增加仅作稀释的对照组和只用乙醇而不用染料染色的对照组。8.加入等体积的血清（2mL）或其它合适的蛋白溶液（如1%BSA）终止反应，孵育1min以结合多余的染料。注意1：血清（或等效的蛋白浓度）为最优的终止液。如果用完全培养基替代，添加体积为10mL。注意2：不要通过加稀释液C或离心来终止反应。注意3：不要用无血清培养基或缓冲盐，他们会使染料产生聚集。染料聚集使清洗过程中无法洗净，使得分析过程中仍存在未标记的细胞。9.将细胞在20-25℃条件下400×g离心10min，小心吸弃上清。用10mL完全培养基重悬，将重悬液转移至另一新的无菌离心管中，20-25℃条件下400×g离心5min。用10mL完全培养基再清洗两遍以除去没结合的染料。注意1：将重悬液转移至新离心管中，减少了离心管壁残留的染料对洗涤效率的影响；注意2：不要用稀释液C清洗。10.最后一步清洗后，用10mL完全培养基重悬细胞评估细胞回收率，细胞活率和荧光强度（图2。离心重悬细胞至所需活细胞浓度。注意1：染色后的细胞可以用中性甲醛固定，避光条件下，荧光强度至少3周内保持稳定。注意2：染色荧光强度一般为背景的100-1000倍。虽然染色的CV值与细胞种类有关，但荧光分布应该尽量均匀对称。图2.PKH26染色优化MC-38TIL细胞用上述指定PKH26浓度染色，最终细胞浓度为1×107/ml。活力（▲）由FITC染色测定，平均荧光强度（●）用流式细胞仪检测。用20μMPKH26标记后，抗肿瘤TIL特异性和效能没有改变。