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烟草叶片的组织培养一、实验目的本实验通过配制3种不同的培养基来实现烟草种子苗叶片诱导、分化及植株再生从而深刻理解植物细胞的全能性、学习和掌握植物组织培养技术，二、实验原理植物组织培养是从20世纪30年代初期发展起来的一项生物技术。由于其拥有占地少、繁殖系数大等特点，现以在全世界的园林植物尤其是花卉的种苗繁育上得到广泛应用。本文着重介绍组织培养技术的理论原理、操作过程、生产技术以及经济核算等方面的内容，使大家对组织培养在园林植物尤其是花卉的种苗繁育的应用有所了解，为以后的实际操作提供依据。在植物组织培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个离体的细胞、一块组织或一个器官的细胞，通过脱分化形成愈伤组织，并由愈伤组织再分化形成植物体。从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期：起动期、分裂期和形成期。培养基配方设计是组培法育苗中的关键步骤。根据理论与实际经验，对不同种类的花卉及不同的取材部位，需设计出相适应的配方，并从中筛选出最佳者。继代芽增殖培养：很多花卉植物经过2-6周的培养即可分化出大量的不定芽。根据情况可以将这些增殖了大量新芽的外植体重新分割进行几代培养，以扩大繁殖规模直至满足繁殖需要为止。三、实验材料植物材料：烟草植株母液成 分规定量浓缩倍数称取量（mg）母液体积（ml）配制1升培养基吸取量定容编号种类1大量元素KNO3190010190001000100NH4NO316501016500MgSO4·7H2O370103700KH2PO41701017002CaCl2·2H2O44010440010001003微量元MnSO4·4H2O22.31002230100010ZnSO4·7H2O8.6100860H3BO36.2100620KI0.8310083药品：激素（2,4-D、NAA、6-BA浓度均可）、1NNaOH、1NHCl蒸馏水、70%酒精、0.01%升汞仪器：1玻璃杯、1玻璃棒、1pH试纸(5.5-9.0)1瓶无菌水、1个无菌烧杯、1包无菌滤纸、1个无菌白瓷板、培养瓶若干移液器、微波炉、灭菌器、超净工作台、酒精灯、解剖刀、镊子四、实验方法与步骤4.1MS培养基母液的配制素Na2MoO4·7H2O0.2510025CuSO4.5H2O40.0251002.5CoCL2.6H2O0.0251002.54铁盐Na2-EDTA37.31003730100010FeSO4.4H2O27.810027805有机物甘氨酸2.010010050010盐酸吡哆醇0.510025盐酸硫铵素0.11005烟酸0.5100256肌酸100100500050010注意：1．大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl2·2H2O单独配制外，其余化合物混合在500ml烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。2．微量元素母液的配制按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签。3．铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。4．有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。1．制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。2．称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。．生长调节剂母液配制：为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热。激动素（KT）和6-苄基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解。称取50mg生长调节物质，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升则含有生长调节物质0.5mg，配制后一般要求在低温（0~4℃）保存，配制培养基时如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为0.5mg时，则取1ml母液即可。4.2 培养基配制和灭菌4.2.1培养培养基配制程序本次实验使用（1）愈伤组织诱导及其幼芽分化培养基:MS+2,4-D0.5mg/L+6-BA1.0mg/L；（2）幼芽增殖培养基：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L；（3）生根培养基：MS+NAA0.2mg/L。注意事项：上述培养基均在MS固体培养基溶化后降低到50左右后，加入相应激素所得，MS固体培养基的配置过程在此不作过多赘述上述培养基均附加3%蔗糖，0.8%琼脂，pH5.8，培养温度25±2℃，光照强2000lx。(一).母液吸取量的计算配制培养基的升数公式1：母液吸取量=母液体积（CC）×——————————母液浓缩倍数培养基要求的含量公式2：母液吸取量=———————————（各种生长调节剂）母液每CC的含量（二）各种母液按顺序编号排列A.大量元素；B.CaCl2.2H2O；C.微量元素；D.铁盐；E.有机物；F．生长素萘乙酸（NAA）：配制0.5mg/ml的NAA称取50mg，NAA用少量95%酒精溶解后加蒸馏水定容至1000ml；G..细胞分裂素、激动素（KT）配制0.5mg/ml的KT称50mgKT用少量1NHCL溶解后,加蒸馏水定容至100ml。(三) 配制培养基（1000ml）1.琼脂:称取5~7g琼脂，加入300ml蒸馏水，加热溶解直至完全溶解为止.2.蔗糖3%用质量较好的白糖代替，称取30g白糖，溶于溶有琼脂的300ml蒸馏水中。3.各种母液的吸取（培养基1L）（1）用50ml量筒量取大量元素母液（A）和CaCl2·2H2O母液（B）各100ml（2）分别用10ml移液管或吸管吸取微量元素（C），铁盐（D）母液各10ml（3）用10ml移液管或吸管吸取有机物（H）10ml（4）移取激素 将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中，混合均匀后，加热至80℃左右，用酸度计或精密PH试纸测定培养基的PH一般要求5.8~6.0，过酸过碱则用1NNaoH和1NHCL调整。二．分装：用一个接有胶管的分装器趁热装培养基，1000ml培养基分装到25-30个三角瓶中，每个三角瓶约30ml左右（一般占试管、三角瓶容量1/4~1/3左右）注：培养基勿碰瓶壁。三. 包装：分装好的三角瓶用封口膜包扎好，标明培养基代号即可进行灭菌。用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。4.2.2培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌（高压蒸汽灭菌锅的使用方法）具体操作步骤：1.高压锅放水至平把架；2.把包扎好的培养基装入高压锅;3.盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀.4.然后接通电源.5.压力计升至0.05MPa时，打开放气阀,排除冷空气(此步很重要)。6.排除冷空气后,关闭放气阀，待压力升到0.11MPa位置时，开始计算灭菌时间，具体方法：当压力锅指针升至0.12MPa时，关闭电源，待指针下降至0.11MPa时接通电源，不断重复此操作过程，维持20分钟。7.灭菌时间达到20分钟后，除去电源，打开放气阀(注意要逐渐放气)待高压锅内的空气完全排除后，打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍待冷后再把培养基取出。8. 经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用前能检查培养基有无微生物污染，可将培养基置于25℃下保存4天，如果培养基需要贮存较长时间，可在4℃低温下保存。灭菌高压锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多种型号和规格，无论哪种型号，操作的步骤都很相近。进水→放进培养基→盖紧锅盖→关上放汽阀→检查安全阀→接上加热源→待压力升至0.05MPa时排锅内冷空气，关上放气阀→0.11MPa(121℃)下灭菌20~25分钟，保持稳定压力→除热源→逐渐打开放气阀→锅内空气排除完后→开放锅盖→稍冷后取出培养基。4.3植物材料表面灭菌——消毒剂灭菌从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。1.接种步骤：第一步：清理材料→→流水冲洗→→加入吐温（或洗衣粉）清洗→→自来水冲洗第二步：对材料的表面浸润灭菌：70%酒精浸10-30秒→→无菌水第三步：灭菌剂处理→→0.1-1%升汞5-8min（或其他灭菌剂）第四步：无菌水进行冲洗注意事项：１.灭菌剂一般要临时配制，现配现用．升汞可以短期储存．２.对去除较容易的灭菌剂灭菌后无菌水冲洗３-４次，升汞一般５-８次，每次不少于３min３.灭菌时要轻轻的搅拌，消除气泡，使消毒更彻底．４.灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止。５.灭菌液要充分浸没材料2.无菌操作可按以下步骤进行：（1）在接种3天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前3小时打开其内紫外线灯进行杀菌；（2）在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；（3）接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；（4）上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。然后搽拭工作台面；（5）先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；（6）接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。（如叶片切成0.5cm2的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1-2片叶原基）在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。（7）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。4.4烟草叶片愈伤组织的诱导和不定芽的分化于超净台中彻底冲洗外植体；70%酒精消毒3min；无菌水冲洗3遍，每遍3mini；将烟草叶片残留的水分用灭过菌的滤纸吸干；白瓷板上用消毒的解剖刀分割为1-1.5cm2的小块；接入相应的MS培养基上，每瓶接种4-5块。接入（1）中培养。约2～3d后，叶片外植体卷曲、增厚、膨胀；15d后外植体脱分化形成疏松絮状浅黄绿色的愈伤组织，愈伤组织诱导率为100%；30d后，从叶片外植体产生的疏松愈伤组织上分化出许多浅黄绿色芽点；60d后，不仅从愈伤组织上分化出越来越多幼芽，芽诱导频率(芽数/块愈伤组织)为25～35，而且还可观察到，该愈伤组织较早分化产生的幼芽叶片呈现不同程度白化（或缺绿）。但此时若将此缺绿幼芽切下，转接至不加2,4-D的幼芽增殖培养基（2）上，3～5d后即可恢复正常，缺绿症状消失，并可不断增殖，发育成绿色健壮的小苗。4.诱导生根及移栽取约3～4cm长的无根小苗接种于生根培养基（3）中，约7～8d后，几乎所有外植体均从其基部产生白色幼根，根诱导频率为3～5，部分在培养基表面的根具大量白色根毛。当试管苗长至5～6cm高时，打开瓶口，在散射光下放置2d后取出，洗去根部残留培养基，种植于经过消毒的珍珠岩、泥炭土和菜园土等量混合的基质中，成活率可达95%以上。5．数据记录烟草叶片愈伤组织诱导情况编号每瓶接种数愈伤组织诱导率愈伤组织状态染菌率烟