叶绿体基因组及其应用

叶绿体基因组及其应用摘要作为植物细胞器的重要组成部分和光合作用的器官，叶绿体在生物进化的漫长历史中发挥了重要作用．伴随着生物技术的深入发展，人们发现叶绿体基因组结构和序列的信息在揭示物种起源、进化演变及其不同物种之间的亲缘关系等方面具有重要价值．与此同时，比核转化具有明显优势的叶绿体转化技术在遗传改良、生物制剂的生产等方面显示出巨大潜力，而叶绿体基因组结构和序列分析则是叶绿体转化的基石．基于叶绿体的这些重要作用，收集整理了有关的资料，从几个方面归纳了本领域最近的研究进展，希望能使读者对迅速发展的叶绿体基因组研究有更全面的了解，以及对叶绿体基因组在物种的进化、遗传、系统发育关系等方面的作用有更深刻的认识，同时也希望对叶绿体转化技术的研究和广泛应用产生积极作用．叶绿体是质体的一种，因为绿色而得名，普遍存在于陆地植物、藻类和部分原生生物当中，是细胞内具有自主遗传信息的重要细胞器．由于光合作用发生在叶绿体内，因而成为推进早期生命进化的能量源头，全面了解叶绿体基因组及其在生物进化中的作用，对今后深入研究和充分发挥叶绿体功能具有重要意义．1.叶绿体基因组的结构特征叶绿体基因组DNA(chloroplastDNA，cpDNA)一般为双链环状分子，极少数为线状，如伞藻cetabularia)．叶绿体基因组的大小差别也比较大，如微管植物叶绿体DNA一般为l20～160kb，其中被子植物120kb，裸子植物如银杏(Jinkgobilob)为158kb，石松(Huperzialucidula)为154kb，蕨类植物为l40～150kb，苔藓类如地钱为120kb．藻类尤其是绿藻的叶绿体基因组DNA的变化很大，小的只有37kb，如一种寄生性的绿藻(Helicosporidiumsp.exSimuliumjonesii)，而伞藻的叶绿体基因组则高达2000kb．目前的研究结果表明，叶绿体基因组的结构非常保守．图1所示为烟草叶绿体基因组结构，双链环形DNA有4个基本部分组成，分别是大单拷贝区(Largesinglecopyregion，LSC)，小单拷贝区(smallsinglecopyregion，SSC)，反向重复区A(invertedrepeatregionA)，和反向重复区B(invertedrepeatregionB)．2个区域的序列相同但方向相反。叶绿体基因组特点1）环状双螺旋分子，不与蛋白质结合。2）基因组复制和遗传复杂且难以确定。3）基因组大小在120kb-160kb。含120-140个基因。4）某些基因含有内含子。5）有的基因组合可形成操纵子。6）所带基因主要控制tRNA、rRNA及约80种蛋白质合成。叶绿体基因组中含有大量的功能基因，可分成3类，即和光合作用有关基因，和基因表达本身有关的基因和其他生物合成有关的基因．从IR区域分布的基因种类上说，此区段主要分布着编码rRNA的基因(rps)，包括编码16S和23S，中间被编码4.5S和5S2+tRNA的基因(trn)分开，还有些基因的功能未知(ycf基因)．在利用叶绿体作为遗传转化的载体时，一旦外源基因插入到此区域，叶绿体本身就会在对应的重复区域内自动调整拷贝数，可以提高表达效率．2.叶绿体基因组的进化2．1起源研究关于叶绿体的起源，目前大家普遍认可的是“内共生”理论(endosymbiotictheory)，即叶绿体来源于原始的古细菌蓝藻(cyanobacenum)．在这次事件中，具备光合能力的蓝藻首先被没有光合能力的单细胞真核原生生物吞噬，进一步被控制，最终形成相互依赖关系，逐步演化成后面3个主要种群，即绿藻(green)、红藻(red)和褐藻(glaucophyte)，其中部分藻类还进行了第2次共生，第3次共生，甚至第4次共生．这3个种群之间的关系还不是十分清晰，但褐藻一个明显的特征是其叶绿体结构中二层胞膜之间还保留来自祖先蓝藻的肽聚糖壁的遗迹，而另2个种群则没有保留下来．通过分析一种褐藻(Cyanophomparadoxa)叶绿体编码的蛋白质序列，发现这种褐藻比绿藻和红藻的分化时间要早．最古老的真核生物种群化石证明，红藻的首次出现大约是在一亿二千万年前，支持此学说的证据还包括发现了一种光合细胞器蓝小体，结构类似蓝藻，DNA和叶绿体相似，是介于二者之间的一种过渡结构．除此之外，叶绿体细胞分裂的机制还部分类似于其原核生物的祖先.虽然叶绿体基因组的序列以快速增长的方式出现，但是考虑到其庞大的数量，目前数据库中只是其中很小的一部分，有待于今后更多的信息公布．更重要的是，和生产息息相关的主要农作物的叶绿体基因组信息还很有限，需要进一步加强．确认叶绿体基因组中合适的重组整合位点，克服主要农作物叶绿体转化进展缓慢的矛盾旧，是目前亟待需要解决的关键问题．2．2基因的转移和丢失在不同的共生事件中，大量共生体基因转移到寄主细胞的核基因组中，这个过程发生的时间跨度上千万年，而且系统发生学研究证明这个过程仍然在继续进行当中．实际上，我们经常可以在植物的核基因组里发现叶绿体基因的片段，如在烟草、水稻等植物中都发现了基因转移的证据，而拟南芥（rabidopsisthaliana)核基因组序列则揭示了高达18％的基因是祖先蓝藻通过内共生途径转移到核里的.叶绿体基因除了向核基因组转移外，还可以向线粒体中转移，但似乎这种转移仅在高等植物中出现，而在苔藓、绿藻和红藻中没有发现．转移到线粒体中的基因往往变成没有功能的假基因，只有在极少数情况下会整合到线粒体基因组中并发挥作用.尽管知道基因转移在高等植物中经常发生，但对其究竟如何转移，又如何整合到核基因组中的内在机理却知之甚少，仅知道染色体断裂、DNA的修复功能在其中起一定作用.3.叶绿体遗传转化叶绿体转化系统，独立于传统的核转化，为植物导入外源基因提供了新途径。它有如下优点：超量表达目的基因；以定点整合方式导入外源基因从而消除了位置效应及基因沉默；具原核表达方式，能以多顺反子的形式表达多个基因；母系遗传方式可防止基因扩散；基因产物区域化并能提供适于某些产物发挥功能的小环境等.3.1叶绿体转化系统的建立及发展3.1.1叶绿体转化系统的建立为减轻目的基因大量表达对植物造成的危害，叶绿体很早已成为外源基因产物的储存场所。通过在目的基因5'端加上受体植物内源的导肽序列，利用核转化就可将基因的产物定位于叶绿体。但这种方法首先要合成前体蛋白，然后在导肽的引导下穿过双层膜进入叶绿体，所经环节较多，且受核转化系统自身缺点的限制，因而人们一直在寻找一种更为合适的表达系统。1987年，Klein等人建立了基因枪转化方法。1990年，外源基因首次于高等植物叶绿体中获得瞬间表达。Ye等（1990）又对所创建的轰击转化系统进行改进，建立了一种较为有效的叶绿体转化方法。此外还涌现出许多将外源基因导入叶绿体的方法：农杆菌介导法，显微注射法，玻璃珠法，电激法。其中农杆菌介导法成功例证极少，迄今为止仅有两例，法、电激法至今未能获得稳定的转化体，玻璃珠法无法应用于高等植物，显微注射法近期有较大改进，但距用于高等植物仍有一定距离。目前基因枪转化法是应用广泛的叶绿体转化方法。3.1.2叶绿体转化系统的发展叶绿体转化系统自建立以来一直以目的基因的导入和转基因植株的同质化为研究重点。目前导入方法虽以基因枪法为主，其它方法同样不断得到发展。如Konobauch对显微注射技术加以改进，使之具有大新优点：（1）注射端口小，，可在很大程度上减少对细胞的损伤；(2)应用新型材料galinstan的热膨胀作用为推动力，更易控制推进速度和推入量。由此可见，这一技术有较大应用潜力。4.叶绿体基因组的应用4.1叶绿体转化系统的应用自较为完善的叶绿体转化系统出现以来，迅速在多个领域发挥其优势：超量表达特定基因用于粮食作物及蔬菜的品质改良；表达抗虫基因以提高农作物的抗虫能力；作为“生物反应器”生产一系列基因工程产品。作为生物改良的有效手段，叶绿体遗传转化为今后的作物产量、抗性、品质改良、生物反应器、生物制药等众多领域开创了新机会，尤其是在生物安全方面的优势，将很快成为今后生物技术领域的主导力量．尽管最新的研究表明，外源基因可以通过花粉途径“泄露”出来，但极低的几率可以使污染的风险从根本上得到解决，消除公众的心理影响．另外，利用叶绿体转化的高效率表达，可以极大地降低疫苗和生物制剂的生产成本，可以让大多数人都有机会享受最新的科技成果．例如，用烟草叶绿体转化生产炭疽病疫苗，一英亩转化烟草可收获40公吨的叶片，即使在纯化过程中损失50％，仍可得到3．6亿单位的剂量，而且具有完全活性．4.2植物光合作用的机制和代谢调控研究的应用作为光合作用的中心，叶绿体基因组的研究对揭示植物光合作用的机制和代谢调控具有重要意义，同时，叶绿体中的大量蛋白质来自于细胞核基因组，它本身只是一个半自主的细胞器，对叶绿体基因组的深入研究有助于理解细胞核基因组与叶绿体基因组之间的相互调节作用．利用不同物种光系统之间的差别，通过转化提高作物的光能吸收和转化效率，进一步提高作物产量，这些领域都为叶绿体基因组研究创造了更大的拓展空间．4.3植物系统学跟系统发育学研究的应用近年来通过比较DNA性状来探讨系统发育问题已经发展成为一门专门的学科——分子系统学。在植物分子系统学领域，目前采用的分子数据主要来自两方面：一是叶绿体基因组，另一是核编码的核糖体DNA重复区。通过叶绿体基因组可以在各种分类级别上讨论植物系统学问题，如种内关系、种间关系等.但叶绿体基因组用于系统发育也有不足，首先其为母性遗传，不能单靠它解释居群间的杂交现象。其次。要与其他分子片段信息、传统的形态跟生理特征结合起来，才能更接近系统发育的本来面目。5.问题与展望虽然叶绿体基因组的序列以快速增长的方式出现，但是考虑到其庞大的数量，目前数据库中只是其中很小的一部分，有待于今后更多的信息公布．更重要的是，和生产息息相关的主要农作物的叶绿体基因组信息还很有限，需要进一步加强．确认叶绿体基因组中合适的重组整合位点，克服主要农作物叶绿体转化进展缓慢的矛盾.作为生物改良的有效手段，叶绿体遗传转化为今后的作物产量、抗性、品质改良、生物反应器、生物制药等众多领域开创了新机会，尤其是在生物安全方面的优势，将很快成为今后生物技术领域的主导力量．叶绿体基因组的研究对揭示植物光合作用的机制和代谢调控具有重要意义，同时，叶绿体中的大量蛋白质来自于细胞核基因组，它本身只是一个半自主的细胞器，对叶绿体基因组的深入研究有助于理解细胞核基因组与叶绿体基因组之间的相互调节作用．利用不同物种光系统之间的差别，通过转化提高作物的光能吸收和转化效率，进一步提高作物产量，这些领域都为叶绿体基因组研究创造了更大的拓展空间．