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第六章兽药残留检测技术第一节兽药残留使用兽药的目的防治食品动物疾病促进生长提高饲料利用率兽药的使用情况据1966~1974年统计,美国大约已有78%~80%的食品动物,在其一生中或多或少服用过药物。兽药的残留兽药残留是指动物性产品的任何可食部分含有兽药母化合物或其代谢物。兽药最高残留限量（MRL）：是指某种兽药而在食物中或食物表面产生的的最高允许兽药残留量（单位μg/kg,以鲜重计）。兽药残留主要是由于各种正常用药和药物滥用造成的,另外,休药期过短,是造成动物性食品兽药残留过量的另一个重要原因。休药期：是指自末次给药到动物允许屠宰或其动物性产品（乳、蛋等）获准上市的间隔时间。兽药的危害引起过敏、致畸、致突变及致癌等不良反应。立法为防止动物性食品中可能出现的药物残留损害人体健康,1984年在CAC的倡导下由联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)联合发起组织了食品中兽药残留立法委员会(CCRVDF)。CCRVDF的主要宗旨是:为控制食品中的兽药残留,筛选并建立适用于全球的兽药及其他化学物残留的分析方法和取样方法;对兽药残留进行毒理学评价;按制订世界或地区性法规标准(CodexStandart)的8个步骤,制定动物组织及产品中兽药最高残留限量(MRL)法规及休药期法规。一、常见兽药按用途分类抗微生物药抗寄生虫药激素类药物生长促进剂抗菌药：磺胺药、呋喃类药、喹诺酮类抗病毒药：干扰素抗蠕虫药抗原虫药杀虫药抗生素：青霉素、链霉素、氯霉素1、抗微生物药抗微生物药是指对病原微生物(细菌、真菌、支原体、病毒等)具抑制或杀灭作用,主要有用于全身感染的抗生素、磺胺药及其他化学合成抗菌药。根据化学结构可分类为:(1)氨基糖苷类：链霉素、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、安普霉素等。(2)β-内酰胺类：青霉素、头孢菌素等。(3)四环素类：土霉素、金霉素、多西环素等。(4)氯霉素类：氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考等。(5)大环内酯类：红霉素、吉他霉素、泰乐菌素等。(6)林可胺类：林可霉素、克林霉素。(7)多肽类：杆菌肽、黏菌素等。(8)多烯类：两性霉素、制霉菌素等。(9)磺胺类及抗菌增效剂：磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺异唑、磺胺甲基异唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶等。(10)硝基呋喃类：呋喃西林、呋喃他酮、呋喃要因、呋喃唑酮等。(11)喹诺酮类：萘啶酸、吡哌酸、嗯喹酸、诺氟沙星、环丙沙星、奥比沙星、沙拉沙星、马波沙星等。2、抗寄生虫药抗寄生虫药是指能杀灭或驱除动物体内外寄生虫的药物。畜禽寄生虫病的危害性极大,会给国民经济造成无法估量的巨大经济损失。寄生虫病不仅引起大批畜禽死亡,而且严重影响动物生长率,使乳、肉、蛋、毛、革等畜产品质量下降,数量减少。某些人畜共患寄生虫病,还能直接威胁人类的健康和生命安全。根据药物作用的特点，抗寄生虫药可分为:(1)抗蠕虫药：苯并咪唑类、咪唑并噻唑类、有机磷酸酯类、四氢嘧啶类、水杨酰苯胺类、阿维菌素类、哌嗪衍生物等。(2)抗原虫药：聚醚类离子载体抗生素、三嗪类、二硝基类、氯羟吡啶。(3)杀虫药：有机磷化合物、拟除虫菊酯类化合物等。3、激素与其他生长促进剂(1)性激素动物生产中使用的性激素,包括雌性激素(如:雌二醇、己烯雌酚(己烷雌酚、甲地孕酮、雌烯酮等)和雄性激素(如:甲基睾丸酮、丙酸睾酮、氯睾酮)。(2)生长激素是由动物脑垂体分泌的天然蛋白质激素,主要通过促进蛋白质合成和脂肪分解来促进动物生长,增加瘦肉率,提高饲料转化率。目前在畜牧业生产中使用的主要有牛生长激素(BST)和猪生长激素(PST)。(3)甲状腺素,类甲状腺素及抗甲状腺素。(4)人工合成的蛋白质同化激素人工合成的蛋白质同化激素可促进动物脑下垂体生长激素的分泌。与抗生素一样,伴随着激素活性物质在畜禽生产中的使用种类和数量的不断增加,反对使用的呼声也越来越高。(5)镇静剂和β-肾上腺素阻断剂为了控制被运输及等待屠宰的动物的紧张,有些畜牧业会非法使用镇静剂和肾上腺素阻滞剂。因为猪对于它们所处环境的突然变化特别敏感,随之产生的新陈代谢和紧张会影响肉的质量。二、常见兽药残留的种类与危害1.抗生素类药物多为天然发酵产物,是临床应用最多的一类抗菌药物,如青霉素类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、螺旋霉素、链霉素、土霉素、金霉素等。2.磺胺类药物主用于抗菌消炎,如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶,磺胺眯,菌得清、新诺明等。近年来,磺胺类药物在动物性食品中的残留超标现象,在所有兽药当中是最严重的。3.硝基呋喃类药物主用于抗菌消炎,如呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等。4.抗寄生虫类药物主要用于驱虫或杀虫,如苯并咪唑、左旋咪唑、克球酚、吡喹酮等。而常用的苯并咪唑类抗寄生虫药物有丙硫苯咪唑、丙氧咪唑、噻苯咪唑、甲苯咪唑、丁苯咪唑等。5.激素类药物主要用于提高动物的繁殖和加快生长发育速度,使用于动物的激素有性激素和皮质激素。而以性激素(包括多种内源性性激素、人工合成的类似性激素的类固醇化合物、人工合成的具有性激素某些特性的非类固醇化合物)最常用,如孕酮、睾酮、雌二醇、甲基睾酮,丙酸睾酮、苯甲酸雌二醇、己烯孕酮等。二、食物中兽药残留(1)兽药残留兽药残留是指动物产品的任何食用部分所含兽药的母体化合物及其代谢物，以及与兽药有关的杂质的残留。(2)兽药残留的来源在食品动物体内或动物性食品中发现的违章残留,大都是由用药错误造成的,其原因主要有:①不正确地应用药物,如用药剂量、给药途径、用药部位和用药动物的种类等不符合用药指示,这些因素有可能延长药物残留在体内的时间,从而需要增加休药的天数;②在休药期结束前屠宰动物;③屠宰前用药掩饰临床症状,以逃避屠宰前检查;④以未经批准药物作为添加剂饲喂动物;⑤药物标签上的用法指示不当,造成违章残留物;⑥饲料粉碎设备受污染或将盛过抗菌药物的容器用于贮藏饲料;⑦接触厩舍粪尿池中含有抗生素等药物的废水和排放的污水(如猪经常摄入这种污水);⑧任意以抗生素药渣喂猪或其他食品动物等滥用抗生素,是出现抗生素残留的主要原因。(3)兽药残留的种类(形式)第一类是以游离或结合形式存在的原药及其主要代谢物(除高亲脂性化合物外),因代谢和排泄迅速,不会在动物体内蓄积。但这些物质可能具有毒性作用,而且被人摄入后在体内可生成高度活化的中间产物(亲电子基团、自由基等),因而对消费者具有潜在的危害性。第二类是共价结合代谢物,因其从机体排出相对较慢,它们的存在对于靶动物有潜在的毒性作用,而对于消费者,由于结合残留在人体内不可能再活化,其生物利用率和含量均低,可能只显示很低的毒性。残留毒理学意义较大的兽药按其用途分类主要包括:抗生素类、合成抗菌素类、抗寄生虫类药、生长促进剂和杀虫剂等。抗生素和抗菌素统称抗微生物药物,是最主要的兽药添加剂和兽药残留,约占药物添加剂的60%。(4)影响食品动物组织中药物残留的因素经内服或注射给药的动物,其组织中存在的药物及其代谢物或降解产物的残留。组织中药物残留随药物种类、剂量、给药途径、药物及其代谢物特性的不同而异。在有些情况下,饲料也会影响动物组织中的药物残留,但药物休药期的执行情况是影响组织残留的最重要因素。屠宰后胴体加工过程也是影响药物残留检出率的因素之一。烹调和贮藏温度亦影响残留药物在组织中的稳定性。对于大多数抗微生物药来说,药物从动物体内消除属一级动力学,而大多数组织中药物残留抗微生物活性的丧失是一个零级动力学过程。这表示药物残留量越多,它们从食用组织中消除所需的时间就越长。如果药物添加剂是亲脂性的,那么它们会蓄积在脂肪组织中,而且其消除速度明显比亲水性药物慢。实际上,存在于家禽食用组织、牛肉、羊肉、乳和蛋中的药物残留的种类和发生率差异较大。这是动物屠宰前或其乳和蛋上市前停止用药时间长短的一种反映。四、兽药残留的现状与法规兽药残留主要是由于不合理使用药物治疗动物疾病和作为饲料药物添加剂而引起的。1990年出口日本的1万吨肉鸡,由于检测出抗球虫药氯羟吡啶的残留量超标,要求我国政府销毁所有产品,给我国造成很大经济损失。出口到德国的蜂蜜由于农药“杀虫脒”残留超标而被退货,接着欧共体、美国、日本也相继拒绝进口我国蜂蜜,使我国蜂蜜在世界市场上的销售发生严重因难。1998年4月,从内地出口到香港的生猪,其内脏食后导致17人中毒。其原因是内脏中含有违禁药“盐酸克仑特罗”。此外,我国出口的畜禽产品还多次出现安眠酮类、雌性激素、抗生素等药物残留超标而被取消出口的事件。1995年、1996年,欧盟兽医委员会派员对我国进行了考察和评估,认为我国的兽医卫生状况达不到欧盟的要求,于是做出了从1996年8月1日起,禁止从我国进口禽肉的决定。1997年、1998年欧盟又派员来华考察,结果仍达不到其要求。目前,我国肉、蛋、奶的出口形势仍相当严峻。我国已开始重视动物性食品中的兽药残留问题,制订了各种兽药残留的法律和法规,修订了《动物性食品中兽药残留最高限量标准》,并开始建立了全国范围的兽药残留监控体系。第六章兽药残留检测技术第二节样品前处理样品前处理是指样品的制备和对样品中的待测组分进行提取、净化、浓缩的过程。样品前处理的目的是消除基质干扰、保护仪器、提高检测方法的灵敏度、选择性、准确度、精密度。不同样品前处理方法的选择，需要根据样品中危害残留物质的特点。残留分析中的样品主要是各种食用组织(肌肉、脂肪、肝、肾、皮、血液、蛋、奶及其加工食品)。活体检测中一般采集血浆、尿液和粪便;屠宰场主要采集某种药物的靶组织及其他高浓度的样本,如肝、肾、胆汁、注射部位的组织等。一、生物样品的类型兽药残留分析中,最常用的生物样品是组织样品,其次是奶、血液和尿液样品。(1)动物组织肌肉(除去可见的脂肪)中水分约占75%,蛋白质(肌浆蛋白、肌原蛋白、胶原蛋白和弹性蛋白)占19.0%、脂肪(中性脂肪、脂肪酸和磷脂)占2.5%、糖类1.2%,以及一些无机盐、维生素和酶类。肌浆蛋白(肌红蛋白、糖解酶)可溶于水,肌原蛋白(肌球蛋白、肌动蛋白)溶于浓盐水,胶原蛋白和弹性蛋白(结缔组织)在上述溶剂中均不溶。不同种类动物的食物构成和肌肉的成分,如家禽和牛的肌红蛋白和脂肪含量存在差异,这些变化会影响分析方法的回收率或干扰检测,因此一种动物组织的残留分析方法对其他动物组织样品不一定适用。例如,用水提取鸡肉和牛肉组织中呋喃唑酮,回收率在75%以上;同样的方法提取猪肌肉样品,回收率仅为10%,改用25%乙腈提取时回收率明显提高,推测呋喃唑酮与猪肉中某种蛋白质结合较强。肝或肾组织为代谢或排泄器官,残留物浓度高,消除缓慢,因此常被作为残留检测的靶组织。(2)尿样尿液的主要成分是水、尿素及盐类。它是一种良好的细菌培养基,因而需立即冷藏或防腐处理。冷藏条件一般可置4℃冰箱内。若欲在室温下保存,应在收集尿样后,立即加入防腐剂。常用的防腐剂有甲苯、氯仿或改变尿液的酸碱性,以抑制细菌的繁殖。加入的防腐剂是否干扰测定或与被测组分发生化学反应,应由实验验证,以便选取合适的防腐措施。在所有体液样品中,尿样最容易获得,并且样品量多,内含药物(母体药物及代谢物)浓度高;正常尿液中仅含微量蛋白质,不需去蛋白处理。尿中药物大多呈结合状态,主要以葡萄苷酸和硫酸酯结合物存在,因此无论直接测定或萃取分离之前,都必须将结合态的药物水解,使药物游离出来。尿样pH变化范围大,分析前需调节到一致的pH值。(3)血样血液采集好之后,由于激活了一系列凝血因子,血中的纤维蛋白原形成纤维蛋白,血液逐渐凝固,上层析出澄清的黄色液体称为血清(serum)。分离血清时,可将凝结后的血液置离心机中离心,将上层血清转入另外容器中保存,得到的血清,一般可占全血量的40%左右。若采血后立即将血液转入有抗凝剂(常用肝素)的容器中,并轻轻摇匀,则血液不再凝结,放置后血细胞会缓缓沉降,1~2h沉降完全,上层的黄色液体称为血浆(plasma)。离心使上层血浆与下层血细胞充分分离,将血浆转移至另一容器内供分析。