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第十三章食品中有害物质的检测第一节概述第二节食品中药物残留及其检测（食品中农药残留及其检测）第三节食品中生物毒素及其检测（食品中霉菌毒素及其检测）第四节食品中污染物的检测（食品中其他有害物质及其检测）重点农药测定预处理方法。有机氯、有机磷农残测定的主要方法。有机磷和氨基甲酸酯类农残的快速检测法。黄曲霉毒素B1的测定方法。第一节概述一、有害物质与有毒物质的概念在自然界所有的物质中,当某物质或含有该物质的物料被按其原来的用途正常使用时,若因该物质而导致人体生理机能、自然环境或生态平衡遭受破坏时,则称该物质为有害物质。WHO定义有毒物质:一般的定义为凡是以小剂量进入机体,通过化学或物理化学作用能够导致健康受损的物质。有毒物质是相对的。剂量决定食品中有害物质：在正常食用含有该物质的食品时会对人体的组织器官或生理机能或精神造成任何急性、亚急性、慢性或者致畸、致癌危害的物质。二、食品中有害物质的种类与来源食品中有害物质按性质分三大类：①是生物性有害物质,如黄曲霉、口蹄疫致病菌等；②是化学性有害物质,如DDT、氯丙醇、河豚毒素、重金属等；③是物理性有害物质,如金属屑、石子、动物排泄物、放射性元素等。①内源性危害：食品中天然存在的有毒有害成分，如河豚毒素、苦杏仁苷等；存在于食品中的生理作用成分，如蛋白酶抑制剂；食物中的营养不平衡。②外源性危害：食品中的微生物污染，如经口传染的病菌、细菌毒素、霉菌毒素；人为掺假，有意加入的食品添加剂，如亚硝酸盐；意外或偶然进入食品的化学物质，如残留农药、重金属、多氯联苯。③诱发性危害：在食品加工、储藏过程中诱发食品内或生物体内生成有害物质，如油脂氧化产生过氧化物、亚硝酸盐与胺反应生成亚硝基化合物。食品危害的来源：三、加强食品中有害物质检测的必要性我国目前最常见的食品质量问题？为什么要加强食品中有害物质的检测？卫生指标超标非法添加滥用食品添加剂包装、标签不规范虚假标签、以次充好保证消费者健康企业改进工艺、控制质量进出口贸易、国家地位与信誉四、食品中有害物质常用的检测方法薄层色谱法气相色谱法高效液相色谱法质谱法色—质联用酶联免疫吸附剂测定第二节食品中农药残留及其检测杀虫剂、杀菌剂、除草剂、杀螨剂、植物生长调节剂、杀鼠药…农药残留是指农药施用后，残存在生物体、农副产品和环境中的微量农药原体、有毒代谢产物、降解物和杂质的总称。残留的数量叫残留量。农药残留是目前影响我国食品和农产品安全的主要因素，已经给我国农产品销售、出口和消费者的身体健康带来了严重影响。对人体危害：通过食物和水的摄入、空气吸入和皮肤接触等途径对人体造成多方面的危害，如急、慢性中毒和致癌、致畸、致突变作用等；对环境危害：污染环境，破坏生态平衡。污染食品：使一些食品残留少量农药。食品中农药残留的来源：1.施用农药对农作物的直接污染2.农作物从污染的环境中吸收农药3.通过食物链、生物富集污染食品4.其他来源的污染：事故性污染主要农药有机氯杀虫剂有机磷杀虫剂拟除虫菊杀虫剂氨基甲酸酯杀虫剂1.有机氯农药（Organochlorinepesticides,OCPs）主要有六六六粉(六氯环己烷)、DDT(二氯二苯三氯乙烷)毒性特点：难分解、半衰期10年以上，高残留；污染食品严重，脂溶性强，蓄积于脂肪和脂肪高的组织；中等毒性，致癌、致畸作用。性质：不溶于水，易溶于脂肪、丙酮、乙醇、石油醚、环己烷，对光、热、酸稳定，对碱不稳定。有多种异构体较强杀虫作用2.有机磷农药（OPPs）是含有C—P键或C—O—P、C—S—P、C—N—P键的有机化合物。应用广。（1）分类：高毒有机磷（早期发展，现已被禁止使用）如对硫磷（1605）、内吸磷（1059）、甲胺磷（3911）等；中等毒有机磷如乐果、杀螟松、倍硫磷等；低毒有机磷如敌百虫、马拉硫磷、双硫磷等。S(C2H5O)2PNO2O一六0五(CH3O)2PSCH2CONHCH3O乐果(CH3O)2PSCCHCOOCH3CH3O甲胺磷（2）特点化学性质不稳定，易分解，污染食品后残留时间短，在生物体不易蓄积。在加工处理过程（碾磨、洗涤、去皮、烹调）中可减少。以急性毒性为主，表现出神经中毒症状。长时间接触对肝脏功能有损。过量或施用时期不当或使用高毒农药是造成有机磷农药污染食品的主要原因3.氨基甲酸酯类是一种高效、低毒、低残留的农药。通式：常见的有：甲萘威、呋喃丹、速灭威等。CONHCH3O甲萘威4.拟除虫菊酯类是模拟天然除虫菊酯化学结构而合成的农药。常用的有氯菊酯、溴菊酯、氯氰菊酯、甲醚菊酯。特点：高效、低毒、低残留，在环境中的降解以光解为主；对胆碱酯酶无抑制作用；亲脂性强，可溶于多种有机溶剂，在水中的溶解度小,在酸性条件下稳定，在碱性条件下易分解。食品中农药残留分析检测技术1.薄层色谱法（TLC）2.气相色谱法（GC）占70%3.气相色谱-质谱法（GC-MS）4.液相色谱法（HPLC）5.液相色谱-质谱法（LC-MS）6.超临界流体色谱（SFC）7.毛细管电泳（CE）8.免疫分析（IA）化学法、比色、分光光度法缺少特异性，灵敏度低纸色谱、薄层色谱法GC、HPLCGC-MS、LC-MS定性定量、多残留检测食品中有机氯农药残留量测定GB/T5009.19①GC-ECD法配标准混合使用液样品提取（用丙酮、己烷、乙醚、石油醚等）与净化（用H2SO4磺化）、浓缩（K-D减压浓缩）、GC检测、ECD检测器。色谱柱用硬质玻璃柱，若用不锈钢柱，易引起农药分解。液体样品采样，应用玻璃瓶，不能用塑料瓶。②TLC法（2008年版本的取消了该法，均为GC，①毛细管柱-②填充柱-）K-D浓缩器固定相：1.5％OV－17和2％QF－1混合固定液的80-100目硅藻土食品中有机磷农药残留量的测定GB/T5009.20-2003原理：果蔬中有机磷残留提取有机溶剂净化气化注入GC浓缩色谱柱中分离FPD检测记录色谱峰比较样品和标准品的色谱峰外标定量（多用峰高）果蔬搅碎足量的无水硫酸钠30~100g取样10g振摇0.5h脱色70ml二氯甲烷脱水定容至2ml过滤35ml滤液室温通风挥至近干移入5ml具塞刻度试管0.2~0.8g活性炭二氯甲烷多次研洗残渣样品处理不同种类样品，处理方法有所不同。色谱条件1．色谱柱：玻璃柱，内径3mm，长1.5m～2.0m。担体：60目～80目美国ChromosorbWAWDMCS（酸洗二甲基二氯硅烷化白色担体）（1）分离测定敌敌畏、乐果、马拉硫磷和对硫磷的色谱柱①2.5％SE－30（甲基硅橡胶，极弱极性）和3％QF－1（三氟丙基甲基聚硅氧烷，中等极性）混合固定液②1.5％OV－17（50%苯基-50%甲基聚硅氧烷，中等极性）和2％QF－1混合固定液（2）分离测定甲拌磷、稻瘟净、倍硫磷、杀螟硫磷及虫螨磷的色谱柱①3％PEGA（聚乙二醇己二酸酯，较强极性）和5％QF－1混合固定液②2％NPGA（己二酸新戊二醇聚酯，中等极性）和3％QF－1混合固定液2．气流速度：载气为氮气80mL/min；空气50mL/min；氢气180mL/min（根据仪器选择各自的最佳比例条件）。3．温度：进样口220℃；检测器240℃；柱温180℃，但测定敌敌畏（其稳定性差）为130℃。测定将有机磷农药标准使用液2μL～5μL分别注入气相色谱仪中，可测得不同浓度有机磷标准溶液的峰高，分别绘制有机磷农药标准曲线。同时取试样溶液2μL～5μL注入气相色谱仪中，测得峰高，从标准曲线图中查出相应的含量。二氯甲烷作提取剂毒性较小较便宜说明：国际上多用乙腈作为有机磷农药的提取剂及分配净化试剂，但其毒性较大，且较贵。蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测GB/T5009.199-2003方法一速测卡法（纸片法）实验原理：胆碱脂酶可催化靛酚乙酸脂（红色）水解为乙酸与靛酚（蓝色），有机磷或氨基甲酸脂类农药对胆碱脂酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此可判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸脂类农药的存在。实验试剂：1、固化有胆碱脂酶和靛酚乙酸脂试纸卡片（速测卡）；2、pH7.5磷酸盐缓冲液：分别称取15.0g磷酸氢二钠[Na2HPO4•12H2O]与1.59g无水磷酸二氢钾[KH2PO4]，用500mL蒸馏水溶解。实验步骤：1、整体测定法（1）选取具有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右方形碎片,取5g放入带盖瓶中，加入10mL缓冲溶液，振摇50次，静置2min以上.(2)取一片速测卡，用白色药片沾取提取液，放置10min以上进行预反应，有条件时在37℃恒温装置中放置10min。预反应后的药片表面必须保持湿润。（3）将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。注意：每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。2、表面测定法（粗筛法）（1）擦去蔬菜表面泥土，滴2～3滴缓冲液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。（2）取一片速测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上。（3）放置10min以上进行预反应，有条件时在37℃恒温装置中放置10min。预反应后的药片表面必须保持湿润。（4）将速测卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。注意：每批测定应设一个缓冲液的空白对照卡。结果判断：结果以酶被有机磷或氨基甲酸脂类农药抑制（为阳性）、未抑制（阴性）表示。与空白对照卡比较，白色药片不变色或略有浅蓝色均为阳性结果。白色药片变为天蓝色或与空白对照卡相同，为阴性结果。对阳性结果的样品，可用其他方法进一步确定具体农药品种和含量。注意事项及说明：1、速测卡灵敏度指标如下表所示。部分农药检出限参考表农药名称检出限（mg/kg）农药名称检出限（mg/kg）农药名称检出限（mg/kg）甲胺磷1.7乙酰甲胺磷3.5久效磷2.5对硫磷1.7敌敌畏0.3甲萘威2.5水胺硫磷3.1敌百虫0.3好年冬1.0马拉硫磷2.0乐果1.3呋喃丹0.5氧化乐果2.32、速测卡符合率：在检出的30份以上阳性样品中，经气相色谱法验证，阳性结果的符合率应在80%以上。3、葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇和番茄汁液中，含有对酶有影响的植物次生物质，容易产生假阳性。处理这类样品时，可采取整株（体）蔬菜浸提或采用表面测定法。对一些含叶绿素较高的蔬菜，也可采取整株（体）蔬菜浸提法，减少色素的干扰。4、当温度条件低于37℃，酶反应速度随之放慢，药片加液后放置反应的时间也应相对延长，延长时间的确定，应以空白对照卡用手指（体温）捏3min时可以变蓝，即可往下操作。注意样品放置的时间应与空白对照卡放置的时间一致才有可比性。空白对照卡不变色的原因：一是药片表面缓冲溶液加得少、预反应后的药片表面不够湿润；二是温度太低。5、红色药片与白色药片叠合反应的时间以3min为准，3min后的蓝色会逐渐加深，24h后颜色会逐渐退去。方法二酶抑制率法（分光光度法）实验原理：根据有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制乙酰胆碱酯酶的活性原理，向蔬菜的提取液中加入生化反应底物碘化硫代乙酰胆碱和乙酰胆碱酯酶，如果蔬菜不含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留或残留量低，酶的活性就不被抑制，加入的底物就能被酶水解，水解产物与加入的显色剂反应产生黄色物质。如果蔬菜的提取液含有农药并残留量较高时，酶的活性被抑制，底物就不被水解，当加入显色剂时就不显色或颜色变化很小。用分光光度计在412nm处或农药残毒快速检测仪测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，就可以判断蔬菜中含有机磷或氨基甲酸酯类农药残留量的情况。试剂：1、pH8.0缓冲液11.9g无水磷酸氢二钾与3.2g磷酸二氢钾，溶解于1000mL蒸馏水中。2、乙酰胆碱酯酶根据酶活力用缓冲溶液溶解，3min的吸光值变化ΔA0值应控制在0.3以上。摇匀后在4℃冰箱中保存，保存期不超过4天。3、底物25.0mg碘化硫代乙酰胆碱，用3.0mL缓冲溶液溶解，4℃冰箱保存。保存期不超过2周。4、显色剂160mg二硫代二硝基苯甲酸和15.6mg碳酸氢钠，用20mL缓冲溶液溶解，4℃冰箱保存。5、可选