质谱发展历史-基础知识

第一章简介一.质谱的发展历史1906年J.JThomson在实验中发现带电荷离子在电磁场中的运动轨迹与它的质荷比(m/z)有关,并于1912年制造出第一台质谱仪.1946年发明飞行时间质量分析器(Time-of-flightAnalyzer)1953-1958年出现四极杆质量分析器(Quadrupole)1956年GC-MS开始联用1959年质谱首次用于peptidesequencing1965年离子共振质谱出现1968年电喷雾离子源ElectrosprayIonization1973年LC-MS1974年FouriertransformioncyclotorresonanceMS1987-1988年Matrise_assistedlaserdesorptionionization1996年电喷雾离子源开始用于生物大分子的研究什么是质谱仪?质谱仪是按照离子的质荷比(m/z)不同,来分离不同分子量的分子.测定分子量进行成分和结构分析.离子的生成方式有失去或捕获电荷(如:电子发射,质子化或去质子化)主要组成部分:1.进样部分2.离子源3.质量过滤器(分析器)4.离子检测器离子源质量过滤/分析器检测器进样部分样品板LC或GCEI源FAB源MALDI源ESI源QuadruopoleIontrapTime-of-flight电子倍增器闪烁计数器第二章质谱仪的组成+++++++++++++++++++++++++++++++++++++第一节进样部分要求：大气压下的样品要进入高真空的质谱仪，而不影响仪器的真空度。方式：进样板进样进样头进样毛细管进样（从气相色谱及液相色谱柱）第二节离子源A:EI源ElectronIonization是1980年以前的主要离子化方式,只能用于远远小于生物有机分子的小分子(400Da以下)的检测,样品需经过汽化(通常热解吸附)进入电离区,与电子流撞击.电子流传递部分能量(多小于6ev)形成离子及部分碎片.EI的优缺点优点1.级的灵敏度2.有达10万个化合物的数据库可快速检索3.可根据碎片方式鉴定未知物4.从碎片离子判定结构缺点1.质量范围小2.有可能汽化前发生解离3.碎片过多有时看不到分子离子B.FBI快速原子/离子轰击离子源FastAtom/IonBombardment使用高能量的氙原子Cs+离子或甘油-NH4+集团喷射样品靶上的样品和基质表面,基质是溶解样品的非挥发性溶剂,样品从基质中解吸附并汽化,离子化.基质的作用是溶解样品;吸收大部分能量,有助于样品离子化并保护样品不被高能量撞击破坏.FBI优缺点优点1、质量数可以做到7000Da。2、快速。3、软电离方式，碎片离子少。4、容易引入阳离子形成M+Na⁺,M+K⁺型的正离子。5、分辨率高。基质可作为参照离子进行精确质量测定。6、大质量的甘油团形成多电荷可测生物大分子。缺点1、质量数高时灵敏度下降严重。2、灵敏度比MALDI,ESI低。3、碎片少，结构信息少。4、基质多峰，干扰结果分析。5、样品必须能溶于基质。6、非极性物质难以离子化。C:MALDI激光解吸附离子源Matrix-AssistedlaserDesorption/IonizationMALDI源的出现解决了生物大分子的离子化难题，离子化过程与FBI有相似之处。1、使用基质，但基质为固体。2、MALDI用脉冲激光束轰击样品和基质的共结晶。对基质的要求是能吸收337nm紫外光并气化，能量由基质传给样品使样品一起气化并离子化。常用基质1、α氰基－4羟基－肉桂酸CCA多肽2、3,5－二甲氧基－4－羟基肉桂酸SA蛋白3、龙胆酸（2,5－二羟基苯甲酸DHB聚合物4、吡啶甲酸PA5、3－羟基吡啶甲酸3HPAMALDI源由氮激光器产生短周期脉冲激光，产生的多为单电荷离子，效率很高，即使只有极少的样品也可分析常用基质结构DHBSACCAMALDI的优缺点优点1、质量数可达300,000Da。2、attomole至femtomole级灵敏度。3、软电离方式，无或极少碎片离子。4、耐盐（样品含盐可达毫摩尔浓度）。5、适于分析复杂混合物。缺点1、分辨率低。2、1000Da以下基质峰干扰。3、激光解吸附离子化有可能使样品光降解。4、串联质谱功能较弱，除非接反射装置进行源后衰变测量。5、不能分析非共价键相互作用。6、定量时需要内校准。7、如没有反射飞行装置，不能分析多肽修饰。8、对各种赋形剂的容忍度低（如含磷酸缓冲液，大于150mM的盐等。SamplesubmissionInsolution,asconcentratedaspossible,volume10-20ulMinimumConcentration10pmol/microliterUse200ulPCR-styleeppendorftubesThesampleshouldNOTcontainanyAzideSDSBrij35TrisbaseCHAPSTritonX-100,TreducedTritonX-100DMSOTweenDMFZwittergentGlycerolanyotherdetergentPhosphatebuffersSaltsandbuffers100mMThefollowingcomponentsareACCEPTABLEAceticorformicacidAcetonitrile,ethanolGuanidine/HCl4MHexafluoroisopropanolupto40%MethanolSodiumchloride10mMUrea1MD:ESI离子源ElectrosprayIonization4000v强电场中，样品溶液通过毛细管喷嘴喷出，带电液滴被静电场吸向质谱人口，同时伴随干燥或加热干燥气体吹送，使液滴表面溶剂挥发,液滴体积变小，表面电荷密度变大，当同种电荷之间的库仑斥力达到雷利极限时，突破表面张力，液滴爆裂为更小的带电液滴，这一过程不断重复，使最终的液滴非常细小，呈喷雾状，此时液滴表面电场非常强大，使分析物离子化，带单电荷或多电荷。一般分析物分子量2000Da带单电荷或双电荷2000Da带多电荷NANO-ESI喷雾照片ESI特点1、ESI产生的生物大分子离子如多肽蛋白等常常带10个以上电荷，使得m/z大大减小，弥补了四极杆质量分析器等质量范围窄的缺点。2、质谱图显示的是离子带不同电荷数的一系列质荷比峰，根据峰位置换算成质量数和电荷数。电荷数和质量数的计算已知mj=(m+nj)/njmk=(m+nk)/nknj=nk+1推算出nj=(mk-1)/(mk-mj)nk=(mj-1)/(mk-mj)m=mj·nj-nj=mk·nk-nkm/z相对丰度mjmkESI优缺点优点1、质量数可达70，000Da2、灵敏度高达femtomole级。3、软电离，可观察生物分子非共价反应。4、易于和LC串联，直接分析流速为1ml/min的LC洗脱液。5、没有基质干扰。6、适于联四极杆质量分析器、离子阱质量分析器做结构分析。7、带多电荷，允许质量范围窄的设备检测高质量数的离子。8、带多电荷，通过计算平均值给出更精确的质量数。9、特别适于测多肽的修饰。10、样品前处理简单可直接分析RP-HPLC脱盐处理的溶液。缺点1、耐盐能力低。2、对某些化合物特别敏感，污染难清洗。3、样品需先气化，混合物不适用。4、带多电荷，在分析混合物时，产生混乱。5、定量时需内校准。E:其他离子化方式阳离子化:以非共价键结合的方式向中性分子加上正电荷。尤其适合质子化不稳定的的分子，质子化是共价键结合，电荷从质子向分子发生转移，这以过程会造成分子的不稳定，使分子裂解。阳离子化没有这一缺点，常用在ESI离子方式中，糖类非常适合这一电离方式，一般多加Na+.阴离子化:分子失去一个质子，带上正电荷，这种离子化方式适合酸性物质，如酚类、羧酸和磺酸。第三章质量分析器（过滤器）第一节：质量分析器的主要指标A、质量范围（ｍ/ｚ）所能测量的质荷比范围[M+nH]ⁿ⁺B、灵敏度一定浓度样品产生响应时，最低的浓度值。nD、分辨率质谱分辨不同质荷比离子的能力分辨率R=M/ΔΜa=M₁/(M₂－M₁)ba公式定义为单峰的质荷比与其半峰宽之比b公式定义为相邻的相交10％的两个峰M₁M₂按a式计算的分辨率约为b式计算的两倍。不同分辨率谱图效果E：分子量的表述方式1、单同位素质量monoisotopicmass最轻的稳定同位素的质量（也有说自然界中丰度最大的同位素的质量）。只有高分辨率的质量分析器才能分离出单同位素峰。2、化学平均分子量M根据同位素质量及丰度计算出平均质量，所有元素的平均质量给出分子的平均质量。3、最高峰质量即未分辨开质谱峰最高处的质量数。表述方式要看分子量及分辨率而定，当m/z高时单同位素峰已不是丰度最大的峰，m/z8000时Μ与最高峰质量趋于一至。第二节质量分析器的种类A、四极杆质量分析器QuadrupoleAnalyzerA、B极性相反，加上一个直流电压DC，叠加一个射频电场RF，扫描时固定RF频率，DC：RF保持比率不变，数值递增，使m/z小到大的离子依次通过，取得一张完整的质谱图。DC+RF四极杆质量分析器的优点四极杆质量分析器通常与EI、ESI源联接1、能容忍相对低的真空度（约10x10⁻⁵Torr）2、m/z可达3000，ESI离子源产生的多电荷生物分子离子m/z正好多在3000以内。3、开销低廉。B、离子阱质量分析器三维的四极杆，RF加在环形电极上。环形电极三维的四极杆，RF加在环形电极上。C、飞行时间质量分析器Time-of-FlightAnalyzer离子的E=U·Z=½mv²飞行时间t=t=const·Lvmz反射飞行时间质量分析器(RETOF-MS)UrefTOF对真空度的要求非常高10⁻⁷TorrMALDI源一般同时联接Time-of-FlightAnalyzer和RETOFD、傅立叶回旋共振质量分析器fourierTransform-IonCyclotronResonance质量精度最高，达±0。001％几种质量分析器的比较第三节：质量分析器的串联目的：碰撞诱导产生碎片离子，进行结构解析Collision-induceddissociation(CID)Ionsourceiondaughteriongranddaughterion选择离子MSCIDMS/MSCIDMS/MS/MS空间串联质谱仪A、串联四极杆（三级四极杆）triple-QuadrupoleAnalyzerQ₁为过滤单元Q₂为碰撞单元Q₃为分析单元几种检测方式1、MS方式：所有离子通过Q₁Q₂Q₃到达检测器。2、MS/MS方式：Q₁作为分析器选择母离子(前体离子），Q₂作为碰撞室产生子离子，子离子由Q₃分析。3、MS³方式：三级四极杆的几种扫描模式1、子离子扫描模式：即MS/MS。2、前体离子扫描模式：Q₁依次将所有离子输入Q₂碰撞解离，Q₃设定一个特定子离子值，只检测此特定子离子，Q₃与Q₁联接，当检测器检测到子离子时，质谱仪记录的是Q₁中的子离子值，质谱图显示的是所有产生相同子离子的母离子。3、中性丢失扫描：Q₃扫描与Q₁有一特定质量差异的子离子，谱图显示的是所有特定中性分子丢失的母离子。B、三级四极杆飞行时间质谱仪QuadrupoletimeofflightC、飞行时间飞行时间质谱仪Time-of-flight/time-of-flight时间串联质谱仪A、离子阱质谱仪：B、傅立叶回旋共振质谱仪Fouriertransform-ioncyclotronresonance离子进入共振腔后，通过调控RF，选择特定的母离子留在腔内，再引入惰性碰撞气体碰撞,产生碎片,并检测碎片离子，这一过程不断重复至MSⁿ。几种串联质谱优缺点对比优点缺点三级四极杆质量精度高，分辨率好碰撞能量低，碎片不完全。RTOF价廉前体离子选择困难子离子分辨率低。FTMS质量精