流式细胞仪的荧光补偿问题

流式细胞仪的荧光补偿问题河南大学第一附属医院检验科LaboratoryofthefirsthospitalaffiliatedtoHenanUniversity•1.荧光素为什么会出现荧光？•2.检测前为什么需要进行荧光补偿？•3.荧光补偿的方法有哪些？•4.荧光补偿的原则是什么？荧光发生的机理室温下荧光素分子大部分处于“基态”，当荧光素在一定波长（激发波长）的光的照射下吸收光能后（经染色后的细胞在激光束的照射下），荧光染料吸收能量能级跃迁，进入新的状态，称为“激发态”，处于激发态的分子极不稳定，它可以通过在10-9－10-7秒的极短时间内以发射一定波长的光量子的方式释放所吸收的能量从而返回到基态。这一过程称为荧光发射，也就是发光。荧光素的激发光谱和发射光谱任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱•激发光谱（Excitation，Ex）：–是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。–吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Max•发射光谱（Emission）：–是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光。–发射波峰（最大发射波长）：Em-Max•吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Max488nm氩离子单激光EPICSXL-MCL-1发射波峰--最大发射波长FITC--异硫氰酸荧光素PE--藻红蛋白PE-Cy5--藻红蛋白偶联物XL-单激光四色的荧光光谱示意图藻红蛋白-德州红偶联物，又称ECDXL-单激光四色的荧光光谱示意图PE尽量不与ECD同时使用，因为两者之间干扰程度大，需较大的荧光补偿。荧光染料平均荧光强度比较PerCPAPCFITCECDPC5PE荧光染色对照的设置•阴性对照–空白对照（自发荧光）–同型（ISO)对照（自发荧光＋非特异荧光）实验样本（特异荧光＋自发荧光＋非特异荧光）同型对照的选择–与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型；–与染色的单克隆抗体①相同种属来源②相同免疫球蛋白及亚型③相同荧光素标记④相同剂量和浓度分析类型管功能加入的抗体单色分析1Isotypeγ1-FITC2Sample1,2……A-FITC双色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PE2Compensation1A-FITCγ2a-PE3Compensation2γ1-FITCB-PE4Sample1,2……A-FITCB-PE三色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PEγ1-PC52Compensation1A-FITCγ2a-PEγ1-PC53Compensation2γ1-FITCB-PEγ1-PC54Compensation3γ1-FITCγ2a-PEC-PC55Sample1,2……A-FITCB-PEC-PC5四色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PEγ1-ECDγ1-PC52Compensation1A-FITCγ2a-PEγ1-ECDγ1-PC53Compensation2γ1-FITCB-PEγ1-ECDγ1-PC54Compensation3γ1-FITCγ2a-PEC-ECDγ1-PC55Compensation4γ1-FITCγ2a-PEγ1-ECDD-PC56Sample1,2……A-FITCB-PEC-ECDD-PC5荧光补偿（compensation）定义：指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠（spectraloverlap）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。补偿方法手动补偿自动补偿（flow-set)无论手动或自动补偿都需将单种荧光素标记的单克隆抗体分别进行单色荧光染色※即几色分析就需要制备几个补偿对照管现举例进行FITC、PE、PC5三色手动补偿1.准备ISO（阴性对照管）；IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PC52.通过调节电压，使阴性群体落在双阴性区域；FITC与PE、FITC与PC5、PE与PC5FITC•FITC与PEPE3.上单染管(CD3-PC5、CD4-FITC、CD8-PE)，准备补偿；（注：保持电压绝对不变；开始补偿前，将原补偿全部归零；）调节补偿原则•横平竖直•即X-mean或Y-mean相等双色荧光补偿1双色荧光补偿2双阴双阳单阳CD3-CD4-CD8-CD3-CD4+CD8+CD3+CD4+CD8-CD3+CD4-CD8+前T细胞胸腺皮质细胞胸腺髓质细胞外周血恳请各位老师指正！