人类X染色质的制备与观察

遗传学实验山东大学生命科学学院13级临八1人类X染色质的制备与观察摘要：人类X染色质（巴氏小体）是由雌性哺乳动物体细胞中失活的X染色体在间期细胞核中呈异固缩状态（染色质高度螺旋化），形成直径约1μm，贴近于核膜边缘的染色小体。根据X染色体失活与Lyon假说，雌性哺乳动物的两条X染色体中，只有一条X染色体有转录活性，另一条X染色体无转录活性，呈固缩状，形成X染色质。失活发生在胚胎发育早期，且失活是随机的。本实验以人口腔颊部粘膜细胞、发根毛囊细胞为材料制备X染色质标本，通过硫瑾染色、压片等方法观察巴氏小体。本次试验的目的是掌握鉴定人类X染色质的方法，在显微镜下正确识别X染色质，即Barr小体的形态特征及所在部位，了解X染色体失活的有关假说以及为失活X染色体上的基因所控制的遗传性状地特点。1.引言1.1巴氏小体人类有23对染色体，其中22对为常染色体，另一对为性染色体。女性为XX，男性为XY。X与Y染色体有一部分是同源的，在减数分裂时可以相互配对，其余部分则不同源。Y染色体含有很少的基因，而X染色体则含有大量的基因。男性与女性的常染色体数目是一样的，所含有的基因数目也相等；但是女性含有两条X染色体，而男性一条X一条Y，因此女性性染色体所携带的基因剂量远高于男性，然而研究发现女性伴性遗传基因的表达剂量与男性是大体相同的，其原因可以用剂量补偿效应解释。剂量补偿效应(dosagecompensationeffect)的定义:在XY性别决定机制的生物中，使性连锁基因在雌、雄性别中有相等或近乎相等的有效剂量的遗传效应。也就是说，在雌性和雄性细胞里，由X染色体基因编码产生的酶或其它蛋白质产物在数量上相等或近乎相等。剂量补偿存在两种情况，雌性哺乳动物一条X染色体异染色质化(失活)，只有一条X染色体具有活性，使雌雄动物虽然X染色体数目不同但基因产物的剂量是平衡的；另一种是X染色质的转录速率不同，如果蝇雌性细胞中两条X染色体都有活性，但它们的转录速率低于雄性细胞X染色体的转录速率。1949年M.L.Barr等研究发现雌猫神经元细胞核膜内有凝缩的深染小体，而雄性个体细胞中则没有，这一结构被称为巴氏小体(Barrbody)。进一步研究发现：所有哺乳类雌体细胞中都可以见到这一结构。巴氏小体是由雌性哺乳动物体细胞中X染色质随机失活形成的，在间期细胞核中呈异固缩状态(染色质高度螺旋化)，浓缩、染色深、无活性,贴近于核膜边缘的染色小体。细胞分裂期可形成正常的染色体形态；复制时间比有活性的X染色体稍迟一些。1.2莱昂假说(Lyonhypothesis)1961年,MaryLyon提出了阐明哺乳动物剂量补偿效应和形成巴氏小体的X染色体失活的假说。假说的主要内容包括：①乳动物雌性个体两条X染色体的其中一条在受精后失活。②两条X染色体中哪一条失活是随机的；在同一哺乳动物的体细胞中，有些父源X染色体失活,有些为母源失活。③失活在胚胎早期发生(人类在胚胎发育16天时)，某一个细胞的X染色体一旦失活，这个细胞的所有后代细胞中该X染色体均处于失活状态。当生殖细胞形成时,失活的染色体可恢复。④杂合体雌性在伴性基因的作用上是嵌合体，即某些细胞中来自父方的伴性基因表达，某些细胞中来自母方的伴性基因表达，这两种细胞随机镶嵌存在。遗传学实验山东大学生命科学学院13级临八2虽然大量的证据表明了莱昂假设的正确性，但仍存在一些问题。比如既然女人只有一条X染色体是有活性的，那么XXX和XO的女性也只有一条X染色体有活性，那么为什么会出现异常呢？近年来研究发现：X染色体为局部失活，部分基因不同程度表达；X染色体失活并非随机失活；在生殖细胞发生中，失活X染色体回复活性。X染色体失活始于胚胎发育早期，在X染色体长臂靠近着丝点的一段序列控制X染色体的失活，称为X染色体失活中心（XIC）。X失活中心Xic(X-inactivationcenter,)是一个顺式作用位点,包含辨别X染色体数目的信息和Xist基因。Xic长约1Mb，包括4个已知基因：Xist、Xce、Tsix和DXPas34。其中，Xist是X染色体失活特异性转录因子；Xce在基因组中的组成与X染色体随机失活的选择有关。Barr小体的数目=n-1(n为X染色体数目)正常女人的体细胞间期核中Barr小体为1；正常男人的体细胞间期核中Barr小体为0；XXX女人的体细胞间期核中Barr小体为2，XXXX女人的体细胞间期核中Barr小体为3。正常女性口腔粘膜细胞中，X染色质约15%左右，平均16.4%，不超过30～35%，仅含1个X染色质。男性只有0～3%，平均0.7%。2.材料和方法2.1实验材料2.1.1生物材料：人体口腔颊部上皮细胞，人体发根毛囊细胞。2.1.2仪器及试剂：显微镜、解剖针、牙签、镊子、载玻片、盖玻片、硫堇、1mol/LHCl、蒸馏水、45%醋酸、95%乙醇。2.2实验方法2.2.1观察人口腔颊部粘膜细胞巴氏小体观察刮取颊部粘膜上皮细胞→涂片，晾干→1MHCl解离10分钟→弃去HCl，水洗3次（在片子反面冲水）。用硫瑾染色3-8分钟→漂洗→晾干→镜检2.2.2观察发根毛囊细胞巴氏小体拔取带毛囊头发一段→45%冰醋酸解离5分钟→剥取毛囊→硫堇染色→压片观察（压片前可先用解剖针敲片，使细胞分散）。2.2.3镜检在40倍显微镜下选择核质染色呈网状或颗粒状；核膜清晰，无缺损；染色适度，周围无杂质的细胞观察。3.实验结果巴氏小体在显微镜下为一结构致密的浓染小体，一般靠近核膜处，约1-1.5微米大小。形状多样有卵圆形，三角形，月牙形，线性等。遗传学实验山东大学生命科学学院13级临八3Fig.1显微镜下观察女生巴氏小体（巴氏小体已用箭头标出）4.讨论4.1注意事项（1）本次实验的难点在于标本杂质的控制及染色时间的把握。载玻片要非常干净，洗净酒精浸泡后晾干或烤干，减少杂质。（2）实验前先用水将口漱净，第一遍刮取的样本弃去，尽可能除去口中杂物。注意不要刮破上皮，涂片后要等材料晾干后再染色或解离，防止溶液将材料冲走而丢失材料。（3）取材时注意不要使样品中混入其他细胞。（4）视硫堇浓度确定染色时间，否则造成染色过浅或背景着色皆影响观察。可以先进行预实验，设计一系列的染色时间梯度，镜下观察染色结果，已确定最佳的染色时间。染色时间过短会导致着色浅，无法观察；染色时间过长会导致核质着色深，X染色质体不易区分。（5）在涂片法中冲洗玻片时,应将玻片稍微倾斜,用细水流从玻片的一端将染色液冲洗干净,或将玻片反过来，用自来水冲洗玻片反面，以保证所取材料不被流水冲走。注意必须要在完全干燥之后才能进行镜检,因为未干燥的玻片会使显微镜的物镜受到污染，可能影响观察结果。4.2结果分析（1）在制片观察过程中发现，利用男生口腔黏膜细胞制作的装片中的细胞核内物质均匀，但基本观察不到巴氏小体，见Fig.1（个别男生也观察到存在巴氏小体，如郭星宏、李临川，但数量远远少于女生）。而用女生的口腔黏膜细胞或者毛囊细胞进行观察，则有一部分的装片可以看到明显的巴氏小体，形状基本为卵形或短棒形，见Fig.1，但观察到的巴氏小体大小和数量有较大差距，最多的能达到接近50%，而少的只有10%左右。（2）推测巴氏小体的大小与数量可能与个人性格有某种关联。资料显示：正常女性口腔粘膜细胞中约30-50%有一个巴氏小体，男性则低于1-2%。在实际实验中，对本人的一张以口腔颊部粘膜上皮细胞为材料制成的装片进行了观察和统计。在同一视野下的174个细胞中，有68个含有巴氏小体，所占比例约为39%，属于正常范围内。班里找到巴氏小体占正常细胞比例较多的是杨亚爽同学，找到巴氏小体体积较大的是田海蓉同学，两个女生都比较温柔。而巴氏小体较小的徐嘉蔚同学平时比较大大咧咧。最早找到巴氏小体的男同学是郭星宏同学，这位同学平时说话比较温柔，动作也比较妩媚。另外一位找到巴氏小体的男同学是李临川，但是这位同学不论从性格上还是外型上都比较“男人”。（3）就算是女性，巴氏小体也不是每个细胞都能看到，因为观察角度不同，可能会被遮掩ABCD遗传学实验山东大学生命科学学院13级临八4或者受细菌的干扰，也就是说，阴性细胞也是可能有巴氏小体的，“阴性”只表示在检测制下无法看到。男性也会有巴氏小体，因为男性细胞中的X染色体具有很低概率可进入异染色质状态，从而成为被观测到的“巴氏小体”，这类细胞通常是暂时活动减弱或进入休眠的细胞。Fig.2显微镜下观察男生的对照组染色（来自苏骁男同学，未发现巴氏小体）5.参考文献[1]王明艳,宁树成,韩秀玲.性染色质观察与性染色体疾病[J].生物学通报,2003,38(10):26-26.[2]李桂英.两种X染色质检查方法的比较[J].现代医药卫生,2008,24(15):2248-2249.[3]李守涛,曾庆韬,薛小桥.人类X-染色质的简易制备方法[J].湖北大学学报:自然科学版,2007,29(2):176-177.