第三章蛋白质一级结构的测定

第三章蛋白质一级结构的测定1969年，国际纯化学与应用化学委员会（IUPAC）规定：蛋白质的一级结构指蛋白质多肽链中AA的排列顺序，包括二硫键的位置。组成一个蛋白质分子的多肽链的数目和多肽链中氨基酸的精确序列是蛋白质一级结构的两个重要方面。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。一级结构(PrimaryStructure)?包括以下几方面内容：①多肽链的数目；②每条多肽链中氨基酸的种类、残基数目和排列次序；③链内或链间二硫键的位置和数目。蛋白质一级结构测定的意义①是推测蛋白质高级结构的分子依据②是理解蛋白质功能的分子基础③是阐明遗传疾病发生机理的分子手段④是研究生物进化的分子佐证测定的基本战略和步骤蛋白质和肽的氨基酸组成分析末端氨基酸的测定亚基拆离、肽链专一性水解和肽片段的分离纯化肽段的序列测定由已知序列肽段建立蛋白质的一级结构第一节测定的基本战略和步骤测定的基本战略测定一级结构的准备工作测定一级结构的基本步骤•蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础；•1953年F.Sanger测定了胰岛素的全部氨基酸排列顺序，从而开创了研究蛋白质一级结构的新纪元；•MooreStein改进了Sanger的方法，完成了第一个酶蛋白(核糖核酸酶)的序列分析；•大肠杆菌半乳糖苷酶1021个AA；•……现在已经有十万种以上不同蛋白质的一级结构被测定。英国Sanger等人于1953年首先完成了胰岛素的全部化学结构的测定工作。胰岛素的分子量为5734道尔顿，由51个氨基酸组成。含A、B两条链,A链：21肽,B链：30肽）。两链由两个链间二硫键连接，第三个二硫键在A链内部形成。611201977BANH3+NH3+COO-•蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础；•1953年F.Sanger测定了胰岛素的全部氨基酸排列顺序，从而开创了研究蛋白质一级结构的新纪元；•MooreStein改进了Sanger的方法，完成了第一个酶蛋白(核糖核酸酶)的序列分析；•大肠杆菌半乳糖苷酶1021个AA；•……现在已经有十万种以上不同蛋白质的一级结构被测定。牛胰核糖核酸酶（RNase）一条多肽链，124AA残基组成，四个链内二硫键，分子量13800。它是测出一级结构的第一个酶分子。蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础；1953年F.Sanger测定了胰岛素的全部氨基酸排列顺序，从而开创了研究蛋白质一级结构的新纪元；MooreStein改进了Sanger的方法，完成了第一个酶蛋白(核糖核酸酶)的序列分析；大肠杆菌半乳糖苷酶1021个AA；……现在已经有十万种以上不同蛋白质的一级结构被测定。用两种裂解肽链的方法,分别得到裂解肽段；分离提纯肽段,测出各个肽段的氨基酸序列；对两套肽段序列比较,找出重叠肽,确定各肽段位置,拼凑整个肽链的氨基酸排序。1.测定的基本战略裂解方法的选择肽段的分离纯化寻找重叠肽B逐级进行特异性裂解(70年代后提出,对测定分子量2-3万以上更有效)防止盲目性,利于肽链顺序的重排裂解后肽段的分离纯化方便选择裂解试剂困难2.测定一级结构的准备工作对样品纯度的要求对蛋白质分子量的测定测定分子中多肽链的数目与种类蛋白质的氨基酸组成蛋白质的配基蛋白质的端基分析样品必需纯（97%以上）……常用来检测蛋白质样品均一性的方法有：①双向分析电泳；②在解离条件下的凝胶电泳；③离子交换层析；④N-末端氨基酸的测定；⑤亲和层析；⑥纯化至恒定比活；⑦肽(酶)谱分析；⑧Western印渍法。通常以电泳时呈现一条带以及末端残基鉴定是单一的样品作为序列测定样品。测定一级结构的准备工作对样品纯度的要求对蛋白质分子量的测定测定分子中多肽链的数目与种类蛋白质的氨基酸组成蛋白质的配基蛋白质的端基分析知道蛋白质的相对分子量……分子量测定的要求并不高，目前用物理化学方法测出的分子量，误差在10%左右就足够了。常用测定方法有：①凝胶过滤法；②SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法；③沉降分析法等估计序列测定工作量的大小计算蛋白质的氨基酸定量组成(M/110)测定一级结构的准备工作对样品纯度的要求对蛋白质分子量的测定测定分子中多肽链的数目与种类蛋白质的氨基酸组成蛋白质的配基蛋白质的端基分析知道蛋白质由几个亚基组成，相同？不同？测定一级结构的准备工作对样品纯度的要求对蛋白质分子量的测定测定分子中多肽链的数目与种类蛋白质的氨基酸组成蛋白质的配基蛋白质的端基分析通过氨基酸组成的分析,确定每条多肽链中氨基酸的种类以及每一种氨基酸残基的数目,对于选择何种裂解多肽链的方法,极为重要,对于建立一级结构也有帮助。测定一级结构的准备工作对样品纯度的要求对蛋白质分子量的测定测定分子中多肽链的数目与种类蛋白质的氨基酸组成蛋白质的配基蛋白质的端基分析①鉴定样品纯度②容易找到末端肽段，对于最后拼成一级结构有帮助③可以知道N末端是否被封闭或酰胺化，减少序列测定中的盲目性3.测定一级结构的基本步骤测定蛋白质分子中多肽链的数目多肽链的拆分根据多肽链的长短和氨基酸组成情况，选择两种切点不同的裂解试剂，分别将多肽链裂解成一系列的肽段选择合适的分离提纯方法，对上述肽段混合物进行分离纯化以获得高纯度的各种肽段用Edman降解法.蛋白质序列仪等测定每一种肽段的氨基酸序列鉴定多肽链的N-末端和C-末端残基比较两套肽段的氨基酸序列,找出接头肽,建立多肽链的一级结构确定S-S,酰胺基、配基在多肽链中的位置第三章蛋白质一级结构的测定测定的基本战略和步骤蛋白质和肽的氨基酸组成分析末端氨基酸的测定肽链专一性水解和肽片段的分离纯化肽段的序列测定由已知序列肽段建立蛋白质的一级结构第二节蛋白质和肽的氨基酸组成分析蛋白质中常见氨基酸的组成及其结构蛋白质中氨基酸组成的测定蛋白质的水解氨基酸的分离和定量测定特殊氨基酸的测定蛋白质中氨基酸组成的表示方法蛋白质营养价值的评价1.蛋白质中常见氨基酸的组成及其结构不变部分可变部分组成蛋白质的常见20种氨基酸中除脯氨酸外，均为-氨基酸，除甘氨酸外都是L-型。丙氨酸Alanine非极性R基团氨基酸H2NCHCCH3OHO-氨基丙酸H3N＋O－2.蛋白质中20种常见氨基酸的结构－按R基团的极性分类丙氨酸Alanine缬氨酸Valine非极性R基团氨基酸H2NCHCCHOHOCH3CH3-氨基异戊酸H3N＋O－蛋白质中20种常见氨基酸的结构－按R基团的极性分类丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine非极性R基团氨基酸H2NCHCCH2OHOCHCH3CH3-氨基异己酸H3N＋O－蛋白质中20种常见氨基酸的结构－按R基团的极性分类丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine非极性R基团氨基酸-氨基--甲基戊酸O││CH2│H2N－CH－C－OH‖CH－CH3CH3H3N＋O－蛋白质中20种常见氨基酸的结构－按R基团的极性分类丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline非极性R基团氨基酸HNCOHO-吡咯烷基--羧酸CHCH2CH2CH2O－H2N＋蛋白质中20种常见氨基酸的结构－按R基团的极性分类丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline苯丙氨酸Phenylalanine非极性R基团氨基酸H2NCHCCH2OHO-氨基--苯基丙酸H3N＋O－蛋白质中20种常见氨基酸的结构－按R基团的极性分类丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline苯丙氨酸Phenylalanine色氨酸Tryptophan非极性R基团氨基酸H2NCHCCH2OHOHN-氨基--吲哚基丙酸蛋白质中20种常见氨基酸的结构－按R基团的极性分类H3N＋O－丙氨酸Alanine缬氨酸Valine亮氨酸Leucine异亮氨酸Ileucine脯氨酸Proline苯丙氨酸Phenylalanine色氨酸Tryptophan甲硫氨酸Methionine非极性R基团氨基酸H2NCHCCH2OHOCH2SCH3-氨基--甲硫基丁酸H3N＋O－蛋白质中20种常见氨基酸的结构－按R基团的极性分类不带电荷极性R基团氨基酸H2NCHCHOHO氨基乙酸甘氨酸GlycineH3N＋O－蛋白质中20种常见氨基酸的结构－按R基团的极性分类甘氨酸Glycine丝氨酸Serine不带电荷极性R基团氨基酸H2NCHCCH2OHOOH-氨基--羟基丙酸H3N＋O－蛋白质中20种常见氨基酸的结构－按R基团的极性分类甘氨酸Glycine丝氨酸Serine苏氨酸Threonine不带电荷极性R基团氨基酸H2NCHCCHOHOOHCH3-氨基--羟基丁酸H3N＋O－蛋白质中20种常见氨基酸的结构－按R基团的极性分类甘氨酸Glycine丝氨酸Serine苏氨酸Threonine半胱氨酸Cysteine不带电荷极性R基团氨基酸H2N－CH－C－OH‖OCH2│SH│-氨基--巯基丙酸H3N＋O－蛋白质中20种常见氨基酸的结构－按R基团的极性分类甘氨酸Glycine丝氨酸Serine苏氨酸Threonine半胱氨酸Cysteine酪氨酸Tyrosine不带电荷极性R基团氨基酸H2NCHCCH2OHOOH-氨基--对羟苯基丙酸H3N＋O－蛋白质中20种常见氨基酸的结构－按R基团的极性分类甘氨酸Glycine丝氨酸Serine苏氨酸Threonine半胱氨酸Cysteine酪氨酸Tyrosine天冬酰胺Asparagine不带电荷极性R基团氨基酸H2NCHCCH2OHOCNH2OH3N＋O－蛋白质中20种常见氨基酸的结构－按R基团的极性分类甘氨酸Glycine丝氨酸Serine苏氨酸Threonine半胱氨酸Cysteine酪氨酸Tyrosine天冬酰胺Asparagine谷氨酰胺Glutamine不带电荷极性R基团氨基酸H2NCHCCH2OHOCH2CNH2OH3N＋O－蛋白质中20种常见氨基酸的结构－按R基团的极性分类带负电荷氨基酸（酸性氨基酸）天冬氨酸AspartateH2NCHCCH2OHOCOHO-氨基丁二酸H3N＋O－蛋白质中20种常见氨基酸的结构－按R基团的极性分类带负电荷氨基酸（酸性氨基酸）天冬氨酸Aspartate谷氨酸GlutamateH2NCHCCH2OHOCH2COHO-氨基戊二酸H3N＋O－蛋白质中20种常见氨基酸的结构－按R基团的极性分类带正电荷氨基酸（碱性氨基酸）赖氨酸LysineH2NCHCCH2OHOCH2CH2CH2NH2，-二氨基己酸H3N＋O－蛋白质中20种常见氨基酸的结构－按R基团的极性分类带正电荷氨基酸（碱性氨基酸）赖氨酸Lysine精氨酸ArginineH2NCHCCH2OHOCH2CH2NHCNH2NH-氨基--胍基戊酸胍基H3N＋O－蛋白质中20种常见氨基酸的结构－按R基团的极性分类带正电荷氨基酸（碱性氨基酸）赖氨酸Lysine精氨酸Arginine组氨酸HistidineH2NCHCCH2OHONNH-氨基--咪唑基丙酸咪唑基H3N＋O－蛋白质中20种常见氨基酸的结构－按R基团的极性分类二十种常见蛋白质氨基酸结构的分类据R基团极性分类极性R基团AA非极性R基团AA（８种）不带电荷（７种）带电荷：正电荷（３种）负电荷（２种）据R基团化学结构分类脂肪族ＡA（中性、含羟基或巯基、酸性、碱性）芳香族ＡA(Phe、Tyr、Trp)杂环ＡＡ(His、Pro)据氨基、羧基数分类二氨基一羧基ＡＡ(Lys、His、Arg)一氨基一羧基ＡＡ一氨基二羧基ＡＡ(Glu、Asp)硒代半胱氨酸：HSe-CH2-CH-COOH│NH2非极性R基团氨基酸不带电荷极性R基团氨基酸带电