抗菌金属材料抗菌性能检测方法研究

抗菌金属材料抗菌性能检测方法研究叶德萍袁周李华袁王智袁马丽侠袁谭和平（中国测试技术研究院，四川成都610021）摘要院为建立检测抗菌金属材料的抗菌性能的方法遥分别用ASTME2149-13a法和ISO22196要要要2011法对抗菌金属的抗菌性能和适用性进行比对研究袁得出这两种方法都不太适合抗菌金属材料的抗菌性能检测遥提出适宜于抗菌金属及其制品的抗菌性能检测方法院采用贴膜法袁抗菌金属材料与菌液的作用时间为2h遥经实验证明院该方法重复性好尧再现性佳袁3种不同抗菌剂处理的金属材料抗菌率袁其重复性分别为5.5%尧5.6%和2.5%袁同种抗菌剂处理的金属材料抗菌率的再现性为5.5%袁说明该方法能应用于抗菌金属及相关材料抗菌性能检测遥关键词院抗菌性能曰金属曰检测方法曰抗菌材料文献标志码院A文章编号院1674-5124渊2016冤05-0066-04StudyondetectionmethodofantibacterialpropertiesofantibacterialmetallicmaterialsYEDeping，ZHOULihua，WANGZhi，MALixia，TANHeping（NationalInstituteofMeasurementandTestingTechnology，Chengdu610021，China）Abstract:Thepurposeofthispaperistodesignadetectionmethodforantibacterialpropertiesofantibacterialmetallicmaterials.TheantibacterialpropertiesweredetectedandtheapplicabilitythereofwascomparativelystudiedwithboththeASTME2149-13aandISO22196———2011methods.Theoutcomesuggeststhatthetwomethodswereunsuitablefortestingtheantibacterialpropertiesofantibacterialmetallicmaterials.Then，ascientificandreasonabledetectionmethodwasputforward.First，theantibacterialmetallicmaterialsandbacterialliquidweremixedwiththestickingmembranemethodtoreactfor2hours.Itisprovedfromthetestresultsthatthismethodisstableandhighlyreproductive.Therepeatabilityoftheantibacterialratesofmetallicmaterialstreatedbythreedifferentkindsofantibacterialagentsis5.5%，5.6%and2.5%respectively.Thereproducibilityofthesamekindofantibacterialagentis5.5%.Itsuggeststhattheproposedmethodcanbeusedtodetecttheantibacterialpropertiesofantibacterialmetalandrelatedmaterials.Keywords:antibacterialproperty；metal；detectionmethod；antibacterialmaterials收稿日期院2016-02-03曰收到修改稿日期院2016-03-13基金项目院2015国家科技支撑计划项目渊2015BAK45B00袁2015BAK45B01冤作者简介：叶德萍渊1983-冤袁女袁四川盐源县人袁助理研究员袁主要从事微生物研究遥通讯作者院谭和平渊1957-冤袁男袁重庆市人袁研究员袁享受国务院政府津贴专家袁主要从事生物化学研究遥0引言随着社会生活资料的不断丰富袁人居环境的安全性及材料的抗菌功能日益受到重视曰因此袁新一代兼有抗菌性能的产品应运而生袁在日常家具尧厨具及卫生用品方面展示出广阔的市场前景[1]遥抗菌材料是指那些具有抑菌和杀菌性能的功能材料袁与普通材料相比袁抗菌产品具有卫生自洁功能袁可免去许多清洁工中国测试CHINAMEASUREMENT&TESTVol.42No.5May，2016第42卷第5期2016年5月doi院10.11857/j.issn.1674-5124.2016.05.014第42卷第5期作袁能有效避免细菌传播袁减少交叉感染袁对改善人们生活质量袁保护健康具有重要意义[2]遥当前对于野抗菌材料冶概念的过度炒作让产品真假难辨袁产品是否使用抗菌材料无从判断袁技术指标无法统一袁技术质量监督和管理很困难袁消费者的合法权益难以得到保障袁对抗菌制品存在信任危机遥所谓的抗菌材料是否真正具有抗菌效果袁抗菌性能究竟如何钥建立一种抗菌材料的抗菌性能检测方法尤为重要遥一方面可以规范市场袁提升产品品质袁另一方面则防止消费者掉入宣传的套路中[3]遥我国虽有SN/T2399要要要2010叶抗菌金属材料评价方法曳[4]袁但该标准内容完全参照JISZ2801要要要2000叶抗菌测试标准曳[5]进行袁JISZ2801要要要2000只有纺织品和塑料的抗菌性能检测方法遥本研究选择可用于抗菌金属抗菌性能检测的标准ASTME2149-13a[6]和ISO22196要要要2011[7]进行复现袁在此基础上研究建立实验室方法袁并对该方法进行方法学考察袁得出适合抗菌金属材料的抗菌性能检测方法遥1材料及方法1.1试剂尧材料和菌株营养肉汤尧平板计数琼脂培养基渊购自北京陆桥技术有限公司冤曰缓冲液渊0.3mmol/LKH2PO4袁自制冤曰覆盖膜渊聚乙烯薄膜袁标准尺寸为渊40依2冤mm伊渊40依2冤mm尧厚度为0.05耀0.10mm袁用70%乙醇溶液浸泡1min袁再用无菌水冲洗袁自然干燥冤曰菌种渊大肠埃希氏菌Escherichiacoli袁ATCC25922冤遥1.2仪器和设备培养箱渊上海智诚ZSD-1270冤曰高压蒸汽灭菌器渊日本TomyES-315冤曰紫外分光光度计渊日本岛津UV-1700冤曰漩涡震荡仪渊厦门XW-80A冤曰水浴锅渊上海精宏DK-8B冤遥1.3菌种活化与菌悬液制备将E.coli保藏菌转接到营养琼脂培养基平板上袁在渊37依1冤益下培养24h袁后每天转接1次袁不超过2周遥试验时应采用连续转接2次后的新鲜细菌培养物渊24h内转接的冤遥用接种环从营养琼脂培养基平板上取少量渊刮1耀2环冤新鲜细菌袁加入营养肉汤中培养18h袁菌液用磷酸盐缓冲液稀释袁直至菌液在475nm的吸光度为0.28依0.02曰菌液再用磷酸盐缓冲液稀释1000倍袁作为工作菌悬液遥1.4样品金属片院分别采用表面经过抗菌处理渊抗菌样品冤和未经抗菌处理渊对照样冤的直径5cm圆形金属片遥1.5抗菌性能检测1.5.1ASTME2149-13a分别将抗菌表面积约为25.8cm2的抗菌金属样品和对照金属样品袁切割成表面积0.5cm2的小片袁放入250mL灭菌三角烧瓶中袁每个烧瓶加入渊50依0.5冤mL工作菌悬液遥并在另一个空三角烧瓶中加入渊50依0.5冤mL菌悬液作为菌液空白对照袁立即对空白对照的菌液作梯度稀释并利用平板计数法对菌的含量计数袁稀释过程不能超过5min遥将3个三角烧瓶放入恒温振荡器袁用最大的震荡速度震荡渊60依5冤min袁立即对每瓶菌液梯度稀释至1000倍袁并用平板计数法对每个梯度做菌落计数袁每个梯度做3个平行袁渊36依1冤益培养24h遥选择30耀300菌落数的平板进行计数袁3个平行菌落数的平均数乘以稀释倍数即为每毫升菌液的菌数遥1.5.2ISO22196要要要2011用平板计数法对工作菌悬液计数并作为菌液空白袁同时分别取菌悬液0.2mL滴加在对照金属片和抗菌金属片上袁对照金属片做6个平行袁每种抗菌金属片样品做3个平行袁用灭菌镊子夹起灭菌覆盖膜分别覆盖在对照金属片和抗菌金属片上袁确保铺平袁使菌均匀接触样品袁且菌液不要超过覆盖膜边缘遥立即回收3个对照金属片上的菌袁用20mL磷酸缓冲液反复冲洗渊最好用镊子夹起薄膜冲洗冤并收集液体袁将收集液充分摇匀后袁作梯度稀释袁取适宜稀释的液体倾注平板计数琼脂袁在渊36依1冤益下培养24h后菌落计数袁作为对照样0h的菌落数遥将剩余的3片对照金属片和抗菌金属片小心置于灭菌平皿中袁在渊36依1冤益尧相对湿度大于90%条件下培养袁培养24h遥培养完成后取出培养的样品袁采用相同方法冲洗金属片及覆盖膜并对收集液做菌落计数遥1.5.3本文改进方法同1.5.2袁对照金属片做9个平行袁0袁1袁2h的各培养3个并作菌落计数曰每种抗菌金属片样品做6个平行袁3个培养1h袁3个培养2h并作菌落计数遥2试验结果及分析ASTME2149-13a方法的抗菌性能检测结果见表1袁将抗菌金属片做了各种抗菌处理袁但是几乎没有抗菌效果袁虽然该方法提出可用于表面有抗菌剂的固体渊如金属片袁塑料袁玻璃袁芯片袁或类似坚硬表面的材质冤袁但从本研究看来该方法不适合抗菌金属片的检测遥ISO22196要要要2011法的抗菌性能检测结果见叶德萍等：抗菌金属材料抗菌性能检测方法研究67中国测试2016年5月试验次数样品菌落数/渊CFU/每片样品冤抗菌率/%备注0h接触时间1h接触时间1h接触时间2h接触时间1菌液空白18900----对照样1470015000---抗菌样-105003044抗菌处理1法2菌液空白40600----对照样3870021600---抗菌样1-183001545抗菌处理3法抗菌样2-115004771抗菌处理4法3菌液空白155000----对照样119000156000---抗菌样-1060003261抗菌处理4法4菌液空白199000----对照样148000117000---抗菌样-692004159抗菌处理4法2h接触时间-30001670-780042802250-3100012000-8100033000表4本文改进方法的抗菌性能检测结果1冤注院1冤抗菌率=渊1h或2h对照样菌落数-抗菌样菌落数冤/对照样菌落平均数遥表2袁样品在培养了24h后袁菌液基本干了袁因此洗脱液培养后都无菌落生长袁只有对照样-3有9CFU袁乘以稀释倍数20袁计算出该金属片上的菌为180CFU袁而其他金属片则是20CFU遥基于此在金属片下垫一个无菌的材料作支撑袁再在培养皿上滴5mL灭菌水袁以保持平皿内的湿度袁培养24h袁此时金属片与覆盖膜之间的菌液未干袁洗脱后作菌落计数袁结果见表3袁培养24h后从金属片和覆盖膜上洗脱下来的菌太多袁有些甚至无法计数袁说明平皿内湿度太高袁又造成了菌的迅速增殖遥试验次数样品菌落数/渊CFU窑mL-1冤抗菌率备注0h接触时间1h接触时间1菌液空白9700097000-抗菌处理1法对照样97000136000-抗菌样9700012600002菌液空白135000145000对照样135000141000抗菌样1350001500003菌液空白350000280000-对照样350000320000-抗菌样13500003500000抗菌处理3法抗菌样23500003800000抗菌处理4法4菌液空白182000161000-对照样182000175000-抗菌样11820001770000抗菌处理5法抗菌样21820001900000抗菌处理6法抗菌样31820001670000抗菌处理7法-抗菌处理2法-0表1ASTME2149-13a法的抗菌性能检测结果1冤注院1冤抗菌率=渊对照样菌落数-抗菌样菌落数冤/抗菌样菌落数遥注院1冤抗菌率=渊24h对照样菌落数平均数-抗菌样菌落数冤/对照样菌落平均数遥样品菌落数/渊CFU/每片样品冤抗菌率备注0h接触时间24h接触时间菌液空白1700