发酵工艺控制

第七章发酵工艺控制温度、pH、氧气、二氧化碳、泡沫发酵染菌的防治与处理发酵终点的判断等发酵是一种很复杂的生产过程，其好坏涉及诸多因素，如菌种的生产性能、培养基的配比、原料质量、灭菌条件、种子质量、发酵条件和过程控制等。研究意义：1、不论是老或新品种，都必须经过发酵研究这一阶段，以考察其代谢规律、影响产物合成的因素，优化发酵工艺条件。2、高产菌种对工艺条件的波动比低产菌种更敏感，故掌握生产菌种的代谢规律和发酵调控的基本知识对生产的稳定和提高具有重要的意义。一、发酵条件的影响及其控制微生物发酵的生产水平取决于生产菌种的特性和发酵条件的控制。了解发酵工艺条件对过程的影响和掌握反映菌的生理代谢和发酵过程变化的规律，可以帮助人们有效地控制微生物的生长和生产。常规的发酵条件：罐温、搅拌转速、搅拌功率、空气流量、罐压、液位、补料、加糖、油或前体，通氨速率以及补水等。表征过程性质的状态参数：pH、溶氧（DO）、溶解CO2、氧化还原电位、尾气O2和CO2含量、基质或产物浓度、代谢中间物或前体浓度、菌浓等。间接状态参数：比生长速率、摄氧率、释放速率（CER）、呼吸商（RQ）、基质消耗速率和产物合成速率等。1、温度对发酵的影响和及其控制微生物的生长和产物的合成都是在各种酶催化下进行的，温度是保证酶活性的重要条件，因此在发酵系统中必须保证稳定而合适的温度环境。(1)温度对微生物生长的影响大多数微生物在20-40℃的温度范围内生长。嗜冷菌在温度低于20℃下生长速率最大，嗜中温菌在30-35℃左右生长，嗜热菌在50℃以上生长。(2)温度对发酵过程的影响温度对青霉菌生长速率、呼吸强度和青霉素生产速率的影响如上图所示。可以看出，温度对参与生长繁殖、呼吸和青霉素形成的各种酶的影响是不同的。(3)温度对发酵液物理性质的影响＃影响氧在发酵液中的溶解度温度溶氧＃影响基质的分解速率如菌体对硫酸盐吸收在25℃时最小(4)温度对生物合成方向的影响30℃35℃金霉素四环素金色链丝菌研究发现，温度与微生物的调节机制关系密切。例如，在20℃时，氨基酸末端产物对其合成途径的第一个酶的反馈抑制作用，比在其正常生长温度37℃时更大。（5）影响发酵温度的因素发酵热发酵热指的是发酵过程中释放出来的净热量，以J/(m3·h)为单位表示。辐射蒸发搅拌生物QQQQQ生物热：生产菌在生长繁殖过程中产生的热叫生物热。营养基质被菌体分解产生大量的热能，部分用于合成高能化合物ATP，供给合成代谢所需要的能量，多余的热量则以热能的形式释放出来，形成生物热。搅拌热：搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之间的摩擦所产生的热能。蒸发热：空气进入发酵罐与发酵液广泛接触后，进行热交换，必然引起水分的蒸发，被空气和蒸发水分带走的热量。Q蒸发=G（I出-I进）辐射热：由于罐外壁和大气间的温度差异而使发酵液中的部分热能通过罐体向大气辐射的热量。发酵热在整个发酵过程中是随时间变化的。所以，为使发酵在一定温度下进行，必须采取措施——在夹套或蛇管内通入冷水加以控制（小型的发酵罐，在冬季和发酵初期，散热量大于产热量则需用热水保温。）（6）最适温度的选择所谓最适温度是指在该温度下最适于菌的生长或产物的合成。对不同的菌种、不同的培养条件、不同的酶反应以及不同的生长阶段，最适温度有所不同。最适生长温度与最适生产温度往往是不一致的。如乳酸发酵，乳链球菌最适生长温度是34C，而产酸最多的温度是30C，但发酵速度最高的温度达40C。青霉素产生菌的最适生长温度为30℃，但产生青霉素的最适温度是24.7℃。★在不同的发酵阶段选择不同的温度•应根据发酵的不同时期，选择不同的培养温度。生长阶段，选最适生长温度，在产物分泌阶段，选最适生产生产温度。即变温控制。•e.g青霉素变温发酵：起初5小时，维持在30C，以后降到25C培养5小时，再降到到20C培养28小时，最后又提高到25C，培养40小时，放罐。青霉素的产量比在25C恒温发酵条件下提高14.7%。★考虑培养基成分和浓度例如，在使用较稀薄或较易利用的培养基时，提高温度则养分往往过早耗竭，导致菌丝过早自溶，产量降低。★参考其它发酵条件例如，通气条件较差的情况下，可以适当降低温度，一方面增加溶解氧浓度，另一方面降低菌体的生长速率，以弥补因通气不足而造成的代谢异常。氧是一种难溶于水的气体。在25℃，1×105Pa条件下，纯氧在水中的溶解度为1.26mmol/L，在28℃氧在发酵液中的溶解度只有0.22mmol/L，而发酵液中的大量微生物耗氧迅速（耗氧速率大于25~100mmol/L.h。在好氧深层培养中，氧气的供应往往是发酵能否成功的重要限制因素之一。2、溶氧对发酵的影响和及其控制好氧微生物的生长和代谢活动都需要消耗氧气，它们只有在氧分子存在的情况下才能完成生物氧化作用。液体中的微生物只能利用溶解氧，气液界面处的微生物还能利用气相中的氧。强化气液界面也将有利于供氧。在微生物的培养过程中，应保持供氧与耗氧的平衡，满足微生物对氧的利用。（1）临界氧发酵生产中用空气饱和度百分数来表示溶氧浓度。这只能在相似的条件下，在同样的温度、罐压、通气搅拌下进行比较。这种方法能反映菌的生理代谢变化和对产物合成的影响。临界氧：不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度，如对产物而言，便是不影响产物合成所允许的最低浓度。各种微生物的临界氧值：细菌和酵母：3~10%放线菌：5~30%霉菌：10~15%注意：●实际上，呼吸临界氧值不一定与产物合成临界氧值相同。●生物合成临界氧浓度并不等于其最适氧浓度。●在培养过程中并不是维持溶氧越高越好。过高的溶氧对生长可能不利。（2）溶氧作为发酵异常的指标生长过程从培养液中溶氧浓度的变化可以反映菌的生长生理状况。发酵溶氧变化异常，可及时预告生产可能出现的问题。★操作故障或事故★中间补料是否得当★污染杂菌：溶氧会反常地迅速（一般2~5h)跌到零，并长时间不回升。这比无菌试验发现染菌要提前几个小时。但有时会出现染菌后溶氧反而升高的现象。微生物的“需氧”可用耗氧速率或呼吸强度来表示：耗氧速率（oxygenuptakerate)：指单位体积的培养液在单位时间的耗氧量。单位为mmolO2/(L·h)，用r表示呼吸强度（respiratorystrength)：单位质量的细胞干重在单位时间的耗氧量。单位为mmolO2/(g·干细胞·h)，用Ｑo2表示两者的关系：（3）溶氧的控制需氧方面XQrO2式中，r——摄氧率，mmolO2/(L·h)；QO2——呼吸强度，mmolO2/(g菌·h)；X——菌浓，g/L。在发酵过程中，影响耗氧的因素有以下几方面：★培养基成分和补料培养基的成分和浓度显著影响耗氧；培养液营养丰富，菌体生长快，耗氧量大；发酵浓度高，耗氧量大；发酵过程补料或补糖，微生物对氧的摄取量随着增大。★菌龄影响耗氧：呼吸旺盛，耗氧力强，发酵后期菌体处于衰老状态，耗氧能力自然减弱。★发酵条件影响耗氧：在最适条件下发酵，耗氧量大。发酵过程中，排除有毒代谢产物如二氧化碳、挥发性的有机酸和过量的氨，也有利于提高菌体的摄氧量。★空气的流速KLa随空气流速的增加而增大，但空气速度过大，则可使叶轮发生过载，即叶轮不能分散空气，气体不经分散而沿搅拌器缓慢运动的中心迅速上升而逸出。★培养液的物理性质发酵液的表面张力、粘度、离子浓度等都会影响气体的溶解度，还影响液体的湍动以及界面和液膜的阻力，因而影响传递效率。发酵液中菌丝浓度增大，表观粘度增大，通气效率下降。发酵过程中添加糖、花生饼粉等营养物质、前体或无菌水、消泡剂等均可改变培养液的理化性质。★空气分布器对通气效率的影响发酵罐中装有多孔分布器和单孔分布器，在气流速度很低时，多孔分布器有较高的通气效率。但两者的区别随着气流速度的增加而逐渐减少。可能是低气流时多孔分布器可形成更大的传递面积，而当通气量增大时，单孔分布器能更大的增加发酵液的湍动程度。方法作用机理投资运转成本效果对生产作用气体成分C*变化中到低高好好搅拌速度KLa变化高低好好挡板KLa变化中低好好通气速率KLa变化低低中不定温度C*、氧需求变化低低变化不定基质浓度氧需求变化中低好不定罐压C*变化中到高低中好电解生产氧C*变化中低高小规模传氧中间介质KLa变化中中好好各种溶氧控制方法的比较KL——氧传质系数，m/h；a——比表面积（m2/m3)c*——氧在水中的饱和浓度，mmol/L；cL——发酵液中的溶氧浓度，mmol/L。发酵过程中培养液的pH值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，是一项重要的发酵参数，它对菌体的生长和产品的积累有很大的影响。3、pH对发酵的影响和及其控制（1）pH对发酵过程的影响pH影响菌体的生长和产物的合成：（1）影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；（2）细胞膜的电荷状态：引起膜渗透性的变化，从而影响菌对养分的吸收和代谢产物的分泌（3）对某些生物合成途径有显著影响：pH值往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的产量和比例发生改变。微生物生长和生物合成的最适pH微生物生长：细菌（6.3~7.5),霉菌和酵母菌（3~6),放线菌（7~8)微生物生长阶段和产物合成阶段的最适pH往往不一样，这不仅与菌种的特性有关，也取决于产物的化学性质。产品菌生长最适pH范围产物合成最适pH范围青霉素6.5~7.26.2~6.8链霉素6.3~6.96.7~7.3四环素6.1~6.65.9~6.3土霉素6.0~6.65.8~6.1红霉素6.6~7.06.8~7.3灰黄霉素6.4~7.06.2~6.5几种抗生素发酵的最适pH范围（2）发酵过程中pH的变化发酵过程中，由于菌种在一定温度及通气条件下对培养基中碳、氮源等的利用，随着有机酸或氨基氮的积累，会使pH产生一定的变化。这种变化的根源是培养基的成分和微生物的代谢特性。引起培养液的pH发生波动的因素引起pH下降的因素：1）培养基中碳、氮比例不当，碳源过多，特别是葡萄糖过量，或者中间补糖过多加之溶解氧不足，致使有机酸大量积累2）消沫油加得过多3）生理酸性物质的存在引起pH上升的因素：1）氮源过多2）生理碱性物质存在3）中间补料中氨水或尿素等的碱性物质加入过多（3）最适pH的选择和调节选择最适pH的原则：既有利于菌体的生长繁殖，又要最大限度地使产物合成获得高的产量。考虑发酵培养基的基础配方，使之有适当的比例，使发酵过程pH的变化在适合的范围内。因为培养基中含有代谢产酸[如葡萄糖产生酮酸、(NH4)2SO4]和产碱[如NaNO3、尿素]的物质以及缓冲剂[如CaCO3]等成分，它们在发酵过程中要影响pH的变化，特别是CaCO3能与酮酸等反应，而起到缓冲作用，所以它的用量比较重要。在分批发酵中，常采用这种方法来控制pH的变化。控制pH的方法利用上述方法调节pH值的能力是有限的，如果达不到要求，可以用在发酵过程直接补加酸或碱和补枓的方式来控制，特别是补料的方式，效果比较明显。现在常用的是以生理酸性物质(硫酸铵)和碱性物质(氨水)来控制。它们不仅可以凋节pH值，还可以补充氮源。当发酵的pH值和氨氮含量都低时，补加氨水，就可以达到调节pH和补充氨氮的目的。反之，pH值较高，氨氮含量又低时，就补加硫酸铵。目前，已比较成功地采用补料的方法来调节pH值，如氨基酸发酵采用流加尿素的方法，特别是次级代谢产物抗生素发酵，更常用此法。既可以达到稳定pH值的目的，又可以不断补充营养物质，特别是能产生阻遏作用的物质。采用补料的方法，可以同时实现补充营养、延长发酵周期、调节pH值和培养液的特性（如菌浓等）等几个目的。最成功的例子就是青霉素的补枓工艺，利用控制葡萄糖的补加速率来控制pH值的变化范围（现已实现自动化），其青霉素产量比用恒定的加糖速率和加酸或碱来控制pH值的产量高25%。4、二氧化碳对发酵的影响及其控制CO2的抑制作用影响菌体生长、形态及产物合成高浓度的CO2会影响产黄青霉的菌丝形态。大多数微生物适应低CO2浓度（0.02~0.04%体积分数）。当尾气CO2浓度高于4%时微生物的糖代谢与呼吸速率下降。（1）CO2对细胞的