谷氨酸合成的方式

第六章味精生产第一节概述一、定义味精：L-谷氨酸单钠的一水化合物，俗称味精，它有强烈的肉类鲜味，将其添加在食品中可使食品风味增强，鲜味增加，是食品的鲜味调味品。味精主要物理性质1、旋光性L-谷氨酸钠为右旋，在20℃，2mol/L盐酸介质中的比旋光度为+25.16。2、溶解度可溶于水和酒精溶液，在水中随温度升高而增大；在酒精中随酒精浓度升高而降低。主要化学性质1、与酸作用生成谷氨酸2、与碱反应生成谷氨酸二钠3、加热脱水反应，生成焦谷氨酸钠味精安全性味精代谢：味精进入胃后，受胃酸作用生成谷氨酸。谷氨酸被人体吸收后，参与体内许多代谢反应，并与其他氨基酸一起共同构成人体组织的蛋白质。人体中的谷氨酸能与血液中氨结合形成谷氨酰胺，从而解除组织代谢过程中所产生的氨的毒害作用。过食可造成体内钠驻留，血管变细，血压升高。味精安全性据最近台湾一项调查发现，约有30%的人由于摄取味精过量而出现了嗜睡、焦躁等现象。味精的主要成分为谷氨酸钠，在消化过程中能分解出谷氨酸，后者在脑组织中经酶催化，可转变成一种抑制性神经传递物质。当味精摄入过多时，这种抑制性神经传递物质就会使人体中各种神经功能处于抑制状态，从而出现眩晕、头痛、嗜睡、肌肉痉挛等一系列症状。建议每道菜味精添加量不应超过0.5毫克。味精安全性使用关于食用味精安全性问题，国际第14届食品添加物专门委员会曾作过如下结论：味精作为食品添加物是极其安全的，除婴儿外，普通人一日允许摄取量为120mg/kg体重。第二节原料及处理谷氨酸发酵以糖蜜和淀粉为主要原料。一糖蜜1糖蜜：是制糖工厂的副产物，分为甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜两大类，其中含较多的可发酵性糖，总糖含量：甘蔗糖蜜54.8%，甜菜糖蜜49.4%；总糖中主要是可发酵性糖。目的：降低生物素的含量。方法：活性炭吸附法：用量为糖蜜的30%—40%水解活性碳处理法：盐酸+活性碳树脂处理法：2糖蜜的处理(1)糖蜜中糖浓度高，必须进行稀释，一般稀释至18～20%。(2)糖蜜中杂质很多，如黑色素、灰分等，必须进行澄清、过滤。一般采用加酸静置，加酸调pH3.0～3.8，并定时通风，除溶液中的SO2、NO2等有害性挥发成分。(3)糖蜜中的含氮物质较少，应补充营养盐，如硫酸氨，磷酸钙等物质。(4)调pH7.0～7.5。(5)灭菌：80～90℃。2糖蜜的处理二淀粉质原料薯类、玉米、小麦、大米等。直链淀粉占17%—27%，其余为支链淀粉。淀粉的水解有多种方法：酸解、酶解，酸酶结合法等，1、酸解法工艺：原料调浆→糖化→冷却→中和脱色→过滤除杂→糖液①淀粉的酸解反应淀粉的酸解葡萄糖的复合反应影响因素葡萄糖的分解反应5-羟甲基糠醛②淀粉酸解法工艺要点糖化条件的控制淀粉乳浓度：10-110Be酸种类与用量：盐酸干淀粉的0.6%，糖化温度和时间：蒸汽直接加热133℃,25min,138℃,15min加酸方式:先加1/3,后2/3。糖化终点判定酒精法，酸解结束前，将少量酸解液滴入无水酒精中，若无白色沉淀出现，表示淀粉水解完全。酸解液的中和液碱酸解液pH1.5,调至4.5酸解液的除杂活性炭干淀粉量0.2%,60-70℃,30min水解糖液的质量要求:还原糖≥18%；糖液清,呈浅黄绿色,550nm处透光率≥90%；无糊精；糖液新鲜2、目前生产中多采用酶解法。工艺流程原料→粉碎→加水→液化→糖化→淀粉水解糖该工艺优点：淀粉的液化条件、方法、控制淀粉糖化水解作用、酶来源、糖化工艺第三节菌株及扩大培养•一、常用的生产菌株•1、谷氨酸生产菌的共同特征•细胞呈球形、棒形或短杆形；•革兰氏染色呈阳性反应；•无鞭毛，不能运动；•是需氧性的微生物；•不形成芽孢；•以生物素作为生长因子；•具有一定的谷氨酸蓄积能力。2、常用的生产菌株•谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、乳糖发酵短杆菌、嗜氨小杆菌、硫殖短杆菌等。•北京棒杆菌AS1.299、北京棒杆菌7338、•北京棒杆菌D110、棒杆菌S-944、•钝齿棒杆菌AS1.542、钝齿棒杆菌HU7251•钝齿棒杆菌9二、培养基的配制•1、斜面培养基•2一级种子和二级种子培养基•①一级种子培养基。•一级种子培养基应该营养丰富，有利于菌体的生长繁殖。为了避免培养过程中因产生有机酸引起培养基pH下降而造成菌体老化，所以培养基的含糖量要低，一般在2.5％左右。②二级种子培养基•通过一级种子扩大培养后，种量还不能满足发酵用的需要，因此需要进一步扩大培养。•二级种子培养基的组成和原料来源应该与发酵培养基相一致，但配比上可有差异，这样就保证二级种子接到发酵罐后能很快适应环境，缩短发酵周期。3发酵培养基•发酵培养基不仅提供菌体生长繁殖所需要的营养和能量，而且是形成谷氨酸的物质来源。因此，这就要求发酵培养基含有足够的碳源和氮源，其量比种子培养基中的含量要高出很多。三、灭菌•1、无菌室的灭菌方法•2、使用高压消毒锅的灭菌条件•3、空罐灭菌•4、实罐灭菌•5、尿素的灭菌•6、消泡剂的灭菌•7、管路的灭菌•8、空气过滤器的灭菌四、空气的净化•1、空气的净化系统•2、过滤介质五、种子扩大培养•工艺流程•保藏菌种→斜面活化→摇瓶种子培养→种子罐→发酵罐•一级种子标准•二级种子标准五、种子扩大培养•1、一级种子培养•通常谷氨酸发酵的接种量为1％。•在1000ml三角瓶中，装入一级种子培养基180～200ml，•摇床上，在30～32℃振荡培养10～12h。•2、二级种子培养•二级种子是在种子罐里培养的，•培养二级种子时的接种量为0.2%～0.5％，温度为32～34℃，培养时间为6～8h。•注意事项：•种子培养基的N源、生物素和P盐适当高，但G2.5%左右。•温度不要波动太大；适当通风搅拌；注意种子培养时间。第四节谷氨酸发酵•一、代谢途径•（一）谷氨酸合成的方式•（1）氨基转移作用（2）还原氨基化作用•NH4+和供氢体[还原性辅酶II（NADPH2）]存在的条件下，a一酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化下形成谷氨酸。（3）其他生物合成方式•谷氨酸合成酶的催化下可产生下列反应：（二）谷氨酸合成途径谷氨酸生物合成途径主要有糖酵解途径（EMP途径）、磷酸己糖途径（HMP途径）、三羧酸循环（TCA）、乙醛酸循环、伍德-沃克反应（二氧化碳的固定反应）等。1．谷氨酸生物合成过程中的途径•(1)糖酵解途径糖酵解分为两个阶段共10个反应，每个分子葡萄糖经第一阶段共5个反应，消耗2个分子ATP为耗能过程，第二阶段5个反应生成4个分子ATP为释能过程。葡萄糖→6-磷酸葡萄糖→1,6-二磷酸果糖→3-磷酸甘油醛→1，3-二磷酸甘油酸→磷酸烯醇式丙酮酸→丙酮酸（2）磷酸己糖途径葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖后，经磷酸己糖途径，可以生成核糖、乙酸辅酶A等芳香族氨基酸的前体物质，这些都是细菌构建细胞所必需的。过程中有6-磷酸果糖、3-磷酸甘油醛和多量NADPH2生成，前两者可以跟糖酵解途径联系起来，进一步生成丙酮酸；后者是a一酮戊二酸进行还原氨基化反应所必需的供氢体。磷酸己糖途径（3）三羧酸循环丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸经脱氨基后，可分别生成丙酮酸、草酸乙酸和a一酮戊二酸。（4）二氧化碳固定反应•由于合成谷氨酸不断消耗a-酮戊二酸，从而引起草酰乙酸缺乏。•为了保证三羧酸循环不被中断和源源不断供给a-酮戊二酸，在苹果酸酶和丙酮酸羧化酶的催化下，分别生成苹果酸和草酸乙酸，前者再在苹果酸脱氢酶催化下，被氧化成草酸乙酸，从而使草酸乙酸得到了补充。（5）乙醛酸循环•谷氨酸生产菌的a-酮戊二酸脱氢酶活力很弱。因此，琥珀酸的生成量尚难满足菌体生长的需要。通过乙醛酸循环异柠檬裂解酶的催化作用，使琥珀酸、延胡索酸和苹果酸的量得到补足，这对维持三羧酸循环的正常运转有重要意义。（6）还原氨基化反应•α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化下，发生还原氨基化反应，生成谷氨酸。•异柠檬酸脱氧过程中产生的NADPH为还原氨基化反应提供了必需的供氧体。（二）、谷氨酸生产菌的生化特征•（1）有催化固定二氧化碳的二羧酸合成酶——苹果酸酶和丙酮酸羧化酶的存在，使三羧酸循环的中间代谢物能得到补充。同时，丙酮酸脱羧酶活力不能过强，以免丙酮酸被大量耗用而使草酰乙酸的生成受到影响。（2）a-酮戊二酸脱氢酶的活性很弱，这样有利于a-酮戊二酸的蓄积。•（3）异柠檬酸脱氢酶活力强，而异柠檬酸裂解酶活力不能太强，这就有利于谷氨酸前体物a-酮戊二酸的生成，满足合成谷氨酸的需要。（二）、谷氨酸生产菌的生化特征•（4）谷氨酸脱氢酶活力高，有利于谷氨酸的生成。•（5）谷氨酸生产菌经呼吸链氧化NADPH2的能力要求弱。•谷氨酸脱氢酶催化a-酮戊二酸还原氨基化反应时，需要有NADH2作为供氢体。如果NADPH2过多地经呼吸链氧化，使所带的氢跟氧结合生成水，那么由于氢的不足，将影响谷氨酸的生成。•（6）菌体本身进一步分解转化和利用谷氨酸的能力要低下，有利于谷氨酸的蓄积。二、谷氨酸发酵的控制•1、温度的控制。•国内常用菌株的最适生长温度为30～34℃，产生谷氨酸的最适温度为34～36℃。•0～12h的发酵前期，主要是长菌阶段；•发酵12h后，菌体进入平衡期，增殖速度变得缓慢；•温度提高到34～36℃，谷氨酸的生成量就增加。2pH的控制•前期•一般发酵前期pH控制在7.5-8.5左右，发酵中、后期pH控制在7.0～7.2，调低pH的目的在于提高与谷氨酸合成有关的酶的活力。•尿素被谷氨酸生产菌细胞的脲酶所分解放出氨，因而发酵液的pH会上升。•发酵过程中，由于菌体不断利用氨，以及有机酸和谷氨酸等代谢产物进入发酵液，使N源不足和发酵液pH下降，需再次流加尿素。3溶解氧的控制•在实际生产中，搅拌转速固定不变，通常用调节通风量来改变供氧水平。•通风比（m3/m3.min）：每分钟向1m3的发酵液中通入0.1cm3无菌空气，用1:0.1表示。4种龄和种量的控制•所谓种龄，是指在正常培养条件下，种子培养的时间。种龄长短关系到种子活力的强弱，影响下一次增殖的适应期长短。•接种量多少，将明显影响种子生长期的长短。5OD值的控制•OD值是细菌个数、菌体大小和发酵液色泽深浅的综合反应。•以B9和T6-13菌株为例，当初糖为12.5％～14%时，长菌期的OD净增值在0.7～0.9。•当细胞进入平衡期后，OD值已达到最大值，此时细胞数不再增加，但因为细胞个体还会继续伸长增大，所以OD值会略有上升。5OD值的控制•生物素是谷氨酸生产菌不可缺少的生长因子。当培养基的生物素将被耗尽时，细菌就停止增殖。•提高生物素的含量，OD值会上升，但一方面细胞的膜通透性会变差，影响谷氨酸从胞内往胞外渗出；另一方面，在高生物素环境下，菌体只进行增殖并不生成谷氨酸。•因此，控制OD值的增长，是保证菌体在胞外大量蓄积谷氨酸的重要手段。6泡沫的控制•生产上为了控制泡沫，除了在发酵罐内安装机械消泡器外，还在发酵时加入消泡剂。•目前谷氨酸发酵常用的消泡剂有：花生油、豆油、玉米油、棉子油、泡敌和硅酮等。天然油脂类的消泡剂的用量较大，一般为发酵液的0.1%～0.2%(体积分数)，泡敌的用量为0.02%～0.03%(体积分数)。三、发酵异常现象及处理•1发酵过程的检查•①OD值的测定•②细胞形态的观察•③还原糖的测定•④pH的测定•⑤温度的测定•⑥通风量的测定•⑦残脲的测定•⑧谷氨酸的测定2异常现象及处理•①污染杂菌和感染噬菌体引起的发酵异常•a.污染杂菌污染杂菌后，OD值增长快，糖耗也快，且发酵液泡沫增多，但谷氨酸生成量少。处理：如果发酵前期发现杂菌污染，可将培养基重新灭菌，并酌加培养基成分，重新接种后再发酵。如果发酵中期发现染菌，而pH、OD值和糖耗等尚属正常，此时可加大风量，按常规继续发酵。如果发酵后期染菌，一般对发酵影响不大。•b.感染噬菌体•感染噬菌体后，OD值不上升甚至下跌，因此发酵液pH上升且变得粘稠，泡沫也增多。发酵液中很少有谷氨酸蓄积。处理：如果发酵前期发现感染噬菌体，可将培养基重新灭菌，或采用并罐法。如果发酵中期发现感染噬菌体，将培养基在70