超氧自由基清除能力测定法-操作图解

1超氧自由基（·O2-）的清除能力测定法（连苯三酚自氧化法）（适用于：SOD及各种抗氧化剂）操作图解具体方法1溶液配制1.1Tris溶液（0.1mol/L）：1.21gTris（三羟甲基氨基甲烷，M.W.121.1）+100mL蒸馏水。1.2HCl溶液（0.1mol/L）：取0.1mL浓盐酸，加蒸馏水稀释到6mL。1.3Tris-HCl缓冲液（0.05mol/L，pH7.4，含1mmol/LNa2EDTA）40mL0.1mol/LTris溶液+xmL0.1mol/LHCl溶液+15.2mgNa2EDTA，混合，稀释到80mL。用pH计测量，pH应为7.4。用棕色瓶保存在冰箱内(最多保存三天)。（以上为一个样品的用量）用前稍热至室温，再测pH值，符合要求即可。1.460mmol/L连苯三酚溶液（溶于1mmol/L盐酸中）取0.1mol/LHCl溶液（见1.2项）20μL，用蒸馏水稀释到2mL，得1mmol/L盐酸溶液（用pH计测量，pH＝2.5-3.0）。再往里加连苯三酚14.6mg(M。W.126.1)，即得。（当天有效,以上为1个样品的用量）。2测试液2.1连苯三酚溶液：取2950μLTris-HCl缓冲液加入到石英比色皿中，再加约50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次A值（325nm），至300秒（5min）时为止。（空白参比：Tris-HCl缓冲液）ΔA＝A325nm,300s-A325nm,30s。由于ΔA值反映了生成·O2的初始浓度，所以，对于同一批实验而言，此时的ΔA值必须相等。此时的ΔA为ΔA0。3.2样品溶液：取xμL样品溶液加入到大石英比色皿中，再加（2950-x）μLTris-HCl缓冲液，再加50μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时,每隔30秒读数一次（A值，325nm），至300秒时为止。（空白参比：Tris-HCl缓冲液）ΔA＝A325nm,300s-A325nm,30s。此时的ΔA为ΔA样。3计算公式2清除率＝(ΔA0-ΔA样)/ΔA0*1004注意事项由于连苯三酚自氧化反应对温度和pH值很敏感，而pH值又受温度的波动而变化。因此，实验过程中，要严格控制温度。缓冲液宜多，比色皿用3.5mL规格。这样数据才比较稳定。5实验结果（以原儿茶酸为例）采用文献[1]的改进方法，测原儿茶酸的·O2-自由基的清除能力，结果如图2（pH7.4）。用旧方法，在pH8.2时测量，结果有很大误差，是不可取的。图2原儿茶酸的·O2-自由基的清除能力的对比（pH7.4vspH8.2）参考文献:[1]XicanLi.ImprovedPyrogallolAutoxidationMethod:AReliableandCheapSuperoxide-scavengingAssaySuitableforAllAntioxidants.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,2012,60:6418-6424.致谢：本文由广州中医药大学李熙灿教授依据其发表的论文[1]，整理而成。