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王彦忠王彦忠王彦忠王彦忠主办单位：中国食品药品监管信息网主办单位：中国食品药品监管信息网主办单位：中国食品药品监管信息网主办单位：中国食品药品监管信息网法规对分析方法验证的要求；2.验证的方法和接受标准；3.分析方法的再验证；4.分析方法的确认；5.常用法规的查询路径。内容介绍：一、法规对分析方法验证的要求第七章第七章第七章第七章确认与验证确认与验证确认与验证确认与验证第一百三十九条：企业的厂房、设施、设备和检验仪器应经过确认和验证，应采用经过验证的生产工艺、操作规程和检验方法进行生产、操作和检验，并保持持续的验证状态。第一百四十二条：当影响产品质量的主要因素，如原辅料、与药品直接接触的包装材料、生产设备、生产环境（或厂房）、生产工艺、检验方法等，发生变更时，应进行确认或验证。必要时，还应经药品监督管理部门批准。10101010版GMPGMPGMPGMP：第十章第十章第十章第十章质量控制与质量保证质量控制与质量保证质量控制与质量保证质量控制与质量保证第二百二十三条：物料和不同生产阶段产品的检验应至少符合以下要求：（二）、符合下列情形之一的，应对检验方法进行验证：�采用新的检验方法；�检验方法需变更的；�采用《中华人民共和国药典》未收载的检验方法；�法规规定的其它需要验证的检验方法。10101010版GMPGMPGMPGMP：（三）、对不需要进行验证的检验方法，企业应对检验方法进行确认，以确保检验数据准确、可靠。10101010版GMPGMPGMPGMP：12.82应在分析仪器/设备完成确认后，再着手分析方法的验证。12.83对已验证分析方法的任何修改均应有完整的记录，这类记录应包括修改的理由和充分的数据，以证实经修改的方法与规定的方法同样准确、可靠。�ICHQ2(R1):Validationofanalyticalprocedures:TextandMethodology;�ICHQ2A:TextonValidationofanalyticalprocedures(parentguideline);�ICHQ2B:Validationofanalyticalprocedures:Methodology(Developedtocomplementtheparentguideline);�USP1225Validationofcompendiamethods.附录XIXA药品质量标准分析方法验证指导原则中只规定了验证项目和基本方法，没有合格标准。相对于在分析方法验证中强调分析方法的耐用性（Robustness），ICH更强调在开发阶段确定分析方法的耐用性。二、验证方法和接受标准药品的生产过程中，原料、中间品、成品均需进行检验，检验结果既是过程受控的依据，也是评价产品质量的重要依据，检验结果应具有准确可靠。而分析方法的验证为检验结果的准确及可靠提供了有力保障。分析方法验证系指确保某项分析方法得出的结果可以持续地准确反映所测产品特性的书面证明。通常分析方法的验证可分为药典或注册分析方法的确认和非药典或注册分析方法的验证。①仪器：仪器已经过验证和校正且在有效期内；②人员：人员应经过充分培训，熟悉方法及所使用的仪器；③物料：所用的物料，包括标准品、试剂、实验用容器等，均应符合试验要求，不能带入污染、误差。如进行高效液相色谱分析时，所用试剂应为色谱级；检查铁盐时使用的盐酸不得含有铁盐等；④方法：该分析方法的开发和优化已经成功完成；⑤环境：试验环境符合该分析方法的要求，例如：有些分析方法可能对温湿度敏感。原则上每个检测项目采用的分析方法，均需要进行方法验证。方法验证的内容应根据检测项目的要求，结合所采用分析方法的特点确定。同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。例如，采用高效液相色谱法用于制剂的鉴别和杂质定量试验应进行不同要求的方法验证，前者重点要求验证专属性，而后者重点要求验证专属性、准确度、定量限等验证项目。（一）需要验证的检测项目检测项目是为控制药品质量，保证安全有效而设定的测试项目。根据检测项目的设定目的和验证内容的不同要求，通常将需验证的检测项目分为鉴别、杂质检查（限度试验、定量试验）、定量测定（含量测定、溶出度、释放度等）、其他特定检测项目等四类。（二）分析方法分析方法是为完成上述各检测项目而设定和建立的测试方法，一般包括分析方法原理、仪器及仪器参数、试剂、系统适用性试验、供试品溶液制备、对照品溶液制备、测定、计算及测试结果的报告等。（三）验证内容验证内容通常包括方法的专属性、线性、范围、准确度、精密度、检测限、定量限和耐用性。�专属性�线性�范围�准确度�精密度（重复性、中间精密度和重现性）�检测限（LOD）和定量限（LOQ）�耐用性不同的分析方法对验证项目的要求：不同的分析方法对验证项目的要求：不同的分析方法对验证项目的要求：不同的分析方法对验证项目的要求：验证项目鉴别杂质定性杂质定量测定含量及溶出度等准确度--++精密度--------重复性--++精密度————中间精密度--++专属性++++检测限-+--定量限--+-线性--++范围--++耐用性++++专属性系指在其他成分（如杂质、降解物、辅料等）可能存在下，采用的分析方法能够正确鉴定、检出被分析物质的特性。通常，鉴别、杂质检查、含量测定方法中均应考察其专属性。如采用的方法不够专属，应采用多个方法予以补充。专属性：专属性：专属性：专属性：1、鉴别反应鉴别试验应确证被分析物符合其特征。专属性试验要求证明能与可能共存的物质或结构相似化合物区分，需确证含被分析物的供试品呈正反应，而不含被测成分的阴性对照呈负反应，结构相似或组分中的有关化合物也应呈负反应。专属性：专属性：专属性：专属性：2、杂质检查作为纯度检查，所采用的分析方法应确保可检出被分析物中杂质的含量，如有关物质、重金属、有机溶剂等。因此杂质检查要求分析方法有一定的专属性。在杂质可获得的情况下，可向供试品中加入一定量的杂质，证明杂质与共存物质能得到分离和检出，并具适当的准确度与精密度。专属性：专属性：专属性：专属性：2、杂质检查在杂质或降解产物不能获得的情况下，专属性可通过与另一种已证明合理但分离或检测原理不同、或具较强分辨能力的方法进行结果比较来确定。或将供试品用强光照射，高温，高湿，酸、碱水解及氧化的方法进行破坏（制剂应考虑辅料的影响），比较破坏前后检出的杂质个数和量。必要时可采用二极管阵列检测和质谱检测，进行色谱峰纯度检查。专属性：专属性：专属性：专属性：3、含量测定含量测定目的是得到供试品中被分析物的含量或效价的准确结果。在杂质可获得的情况下，对于主成分含量测定可在供试品中加入杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，并与未加杂质和辅料的供试品比较测定结果。在杂质或降解产物不能获得的情况下，可采用另一个经验证了的或药典方法进行比较，对比两种方法测定的结果。也可采用破坏性试验（强光照射，高温，高湿，酸、碱水解及氧化），得到含有杂质或降解产物的试样，用两种方法进行含量测定，比较测定结果。必要时进行色谱峰纯度检查，证明含量测定成份的色谱峰中不包含其他成份。专属性：专属性：专属性：专属性：1.应当证明潜在的干扰成分不会对方法的性能产生负作用。对于层析分离方法，要求证实杂质之间﹑杂质与主峰之间的选择性；分辨率≥1.5，如果证明确实可行，某些情况下分辨率低于1.2也可以接受。2.空白对照应无干扰。1.波长的选择；2.每次试验时必须运行空白样品；3.试剂、玻璃容器、流动相和过滤介质可能会影响方法的专属性。线性系指在设计的测定范围内，检测结果与供试品中被分析物的浓度（量）直接呈线性关系的程度。线性是定量测定的基础，涉及定量测定的项目，如杂质定量检查、含量和溶出方法均需要验证其线性。可用一贮备液经精密稀释或分别精密称样，制备一系列的供试品进行测定，至少制备5个浓度（通常选取50％,80%,100%,120%和150％）。线性：线性：线性：线性：并且80%,100%和120%的数据也可以用来确定方法重现性。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，用最小二乘法进行线性回归。必要时，响应信号可经数学转换，再进行线性回归计算。线性：线性：线性：线性：线性的接受标准：线性的接受标准：线性的接受标准：线性的接受标准：1.监测器的设计和型号；2.流动相和被分析物的紫外特性；3.色谱峰的完整性。范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。杂质定量检查、含量和溶出方法均应验证其范围，分析方法的范围应根据具体分析方法以及对线性、准确度、精密度的结果和要求确定。无特殊要求时，通常采用以下标准。范围通常用与分析方法测试结果相同的单位（如百分浓度）表达。涉及到定量测定的检测项目均需要对范围进行验证，如含量测定、含量均匀度、溶出度或释放度、杂质定量试验等。范围：范围：范围：范围：①对于半成品或者成品含量测试，范围通常为测试浓度的80%-120%；②对于杂质测试，范围为测试浓度的50%-120%；③对于含量均匀度测试，除了基于剂型本身特点（例如：计量剂型气雾剂、喷雾剂）而确定的更宽的范围外，范围应为测试浓度的70％～130％；范围的接受标准：范围的接受标准：范围的接受标准：范围的接受标准：④对于溶出度测试，范围应为标准规定范围的土20％。如某一剂型的溶出度规定，1h后溶出度不得小于20％，24h后溶出度不得小于90％，则考察此剂型的溶出度范围应为0～110%。例如：某缓释制剂规定，1小时释放不得小于20%，8小时释放不得小于80%，那么验证范围应当为标示量的0-100%。范围的接受标准：范围的接受标准：范围的接受标准：范围的接受标准：准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般以回收率%表示。准确度为定量测定的必要条件，因此涉及到定量测定的检测项目均需要验证其准确度，如杂质定量检查、含量和溶出方法，分析方法的准确度能够确保：①样品中的待测物全部溶解；②待测物全部从检测器中检出。准确度：准确度：准确度：准确度：准确度的测定至少选取包括标准浓度在内的至少3个浓度级别（通常选取80％、100％和120％），每个浓度级别至少测定3次，计算测定结果的回收率。�原料药1.可用已知纯度的对照品或符合要求的原料药进行测定；2.用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。准确度：准确度：准确度：准确度：�制剂1.用含已知量被测物的各组分混合物进行测定；2.如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定（加样回收试验法）；3.用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。�杂质1.往样品中加入已知量的杂质进行测定；2.若不可能得到某种杂质或降解产物，可把此方法的分析结果与另一已验证的或药典的分析方法获得的结果进行比较。准确度：准确度：准确度：准确度：通常采用回收率测定的试验可分为：空白回收（制剂空白）加样回收（适用于：中药材，复方制剂等）空白回收的计算方法：准确度：准确度：准确度：准确度：加样回收的计算方法：其中：M为测定值；P为背景值；A为已知值（真实值）。准确度：准确度：准确度：准确度：加样回收的试验方法：同一样品，制备三个浓度的供试品，每个浓度分别制备三份供试液，例如：取相同量样品9份（一般为样品取样量的一半），设计三个浓度，按不同比例加入对照品。中间浓度一般按1:1比例加入；低浓度和高浓度可分别选0.5:1和1.5:1的比例，加入对照品的量要适当，保证供试品溶液的浓度（或量）在考察的线性范围内。准确度：准确度：准确度：准确度：含量和溶出：HPLCHPLCHPLCHPLC方法的接受标准方法的接受标准方法的接受标准方法的接受标准各浓度下的平均回收率应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于2.0%。中药一般应满足以下规定：回收率计算值在95%-105%范围，相对标准偏差（RSD%）薄层扫描法