RT-qPCR技术的原理及应用

实时荧光定量PCR技术的原理及应用(RealtimeQuantitativePCR)实时荧光定量PCR定义实时荧光定量PCR定义在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法实时荧光定量PCR原理应用•绝对定量(AbsoluteQuantification，AQ)病原体检测转基因食品检测基因表达研究•相对定量(RelativeQuantification，RQ)高通量基因检测方法的验证药物疗效考核耐药性研究实时荧光定量PCR原理应用中国人终末期肝病组织中乙肝病毒转录体的检测摘要目的:探讨肝组织中HBVDNA和病毒转录体与终末期肝病的关系.方法:用TRIzol从肝组织中提取组织核酸,PCR及RT􀀁PCR扩增HBVXDNA,XRNA,fRNA和trRNA,琼脂糖凝胶电泳显示产物,Southern􀀁blot杂交验证PCR扩增的可靠性.结果:27例HBsAg(+)肝组织,19例HBxDNA/RNA检测均为阳性,其中HBeAg(+)者fRNA检出率较HBeAg(-)者高;22例HBsAg(-)肝组织,有16例可检测到HBxDNA或RNA,HBsAg(-)的隐匿性感染在中国人终末期肝病中有较高的检出率72.7%;HBV病毒转录体trRNA在肝癌及肝硬化组织中的检出率明显高于其他肝脏疾病(P0.05).结论:HBV隐匿性感染与中国人终末期肝病的发生密切相关,肝组织中HBVtrRNA也与终末期肝病关系密切.实时荧光定量PCR原理应用实时荧光定量PCR原理应用实时荧光定量PCR原理实时原理常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析实时荧光定量PCR原理-------Ct值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性实时荧光定量PCR原理---------定量原理•理想的PCR反应：•X=X0*2n•非理想的PCR反应：•X=X0(1+Ex)n•n：扩增反应的循环次数•X：第n次循环后的产物量•X0：初始模板量•Ex：扩增效率非特异性荧光标记：1、SYBRGreen特异性荧光标记：2、TaqMan实时荧光定量PCR原理---------DNA产物的荧光标记实时荧光定量PCR方法1---------SYBRGreen法SYBRGreenSYBRGreen法工作机理SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBRGreen实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitationSYBRGreen法融解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非特异性产物SYBRGreen法------------PCR反应的建立反应体系的建立及优化:1.SYBRGreen使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2.Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3.MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4.反应Buffer体系的优化5.反应温度和时间参数:由酶和引物决定6.其他与常规PCR相同SYBRGreen法应用范围起始模板的测定基因型的分析融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。实时荧光定量PCR法标准样品相对定量中的内标•内标通常是β-actin、GAPDH、18SrRNA基因等看家基因•在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小•内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量绝对定量的标准样品：已知拷贝数的质粒DNA