叶绿素荧光实验指南

叶绿素荧光与光合作用能量转换叶绿素荧光基础实验指南byUlrichSchreiber©HeinzWalzGmbH,1997德国WALZ公司中国技术服务中心上海市中江路879号天地软件园28号楼402-403室UlrichSchreiber著韩志国译Mess-undRegeltechnikChlorophyllfluorescenceandphotosyntheticenergyconversion:SimpleintroductoryexperimentswiththeTEACHING-PAMChlorophyllFluorometer叶绿素荧光与光合作用能量转换叶绿素荧光基础实验指南UlrichSchreiber著©HeinzWalzGmbH,1997韩志国译泽泉科技有限公司，2004德国WALZ中国技术服务中心泽泉国际集团（香港）有限公司泽泉科技有限公司德国WALZ公司中国技术服务中心地址：上海市中江路879号天地软件园28号楼402-403室（200333）电话：[phone]/17/18传真：[phone]E-Mail：[e-mail]网址：德国叶绿素荧光动力学，发展中的应用技术叶绿素荧光动力学（chlorophyllfluorescencedynamics）技术被称为研究植物光合功能的快速、无损伤探针。叶绿素荧光动力学技术在测定植物光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作用,与“表观性”的气体交换指标相比,叶绿素荧光参数更具有反映“内在性”的特点。叶绿素荧光分析具有观测手续简便，获得结果迅速，反应灵敏，可以定量，对植物无破坏、少干扰的特点。它既可以用于叶绿体、叶片和藻类，也可以遥感用于群体、群落。它既是室内光合作用基础研究的先进工具，更是室外自然条件下诊断植物体内光合机构运转状况、分析植物对逆境响应机理的重要方法。自从德国UlrichSchreiber博士于1983年发明并制造了世界第一台PAM100系列脉冲调制荧光仪以来，以独特的设计，稳定而可靠的性能，得到了全世界植物光合研究领域科学家的首肯和青睐。特别是1994年PAM2000便携式叶绿素荧光仪的推出和商品化，使荧光分析在光合作用研究中得到广泛的应用。目前PAM系列荧光仪可以用于植物生理学、植物育种、园艺学、农艺学、林学、生态学、农用化学、海洋与湖沼学、水域生态学、微藻生物技术和环境保护等领域。其研究应用还在不断扩展中：在传统的生理学研究领域：是研究光合作用的必须手段在植物逆境生理研究领域：检测环境压力下的抗逆性在植物保护和农药研究领域：检测农药药害，揭示作用机理在植物营养研究领域：检测营养盐缺乏（与光合过程有关的）在作物遗传育种研究中：研究子代的品质差异，筛选良种在水域生态学研究领域：研究水域光合作用，揭示水体生态系统动力学在微藻生物技术领域：是微藻健康状况的有效探针在环境保护领域：用于环境检测和监测这一技术事实上正在成为目前分子遗传育种中作物品质筛选的简便而有效的方法，其原理是这一技术可以有效的区分出植物的抗逆性能差异，例如在培育抗除草剂作物时，植株外部药害征状未明显出现时，可由荧光测定值显示出其受药剂剂量之影响。这样就提供了一种快速鉴别种质优劣的方法。叶绿素荧光技术正在越来越多的研究领域展示出它的应用前景，我们作为世界叶绿素荧光产品的权威品牌—德国WALZ（PAM系列荧光产品）在中国的技术服务中心，希望与国内研究界加强合作，让这一先进技术助力中国科研，绽放应用光彩！WALZ中国网站暨叶绿素荧光技术中国网站（）即将开通，敬请关注！中国技术服务中心.上海泽泉科技：[e-mail]叶绿素荧光与光合作用能量转换--叶绿素荧光基础实验指南1目录原作者序（UlrichSchreiber）...............................21前言....................................................32叶绿素荧光：光合作用能量转换的探针......................53TEACHING-PAM叶绿素荧光仪................................73.1PAM的测量原理.................................................................................................................73.2TEACHING-PAM的组件..................................................................................................83.3不同的数据获得与系统操作模式.....................................................................................93.3.1“基础模式”的标准操作......................................................................................93.3.2特殊的数据获得与系统操作模式........................................................................114叶绿素荧光基础实验.....................................144.1实验1：叶绿素荧光产量................................................................................................154.2实验2：光系统II量子产量与叶绿素荧光量子产量之间的关系...............................174.3实验3：光系统II量子产量对光强的依赖性和电子传递速率的光饱和...................194.4实验4：通过测量Fv/Fm来研究光抑制.....................................................................214.5实验5：热胁导致的光合作用失活..............................................................................234.6实验6：光系统II的抑制剂DCMU对光合作用电子传递的抑制作用...................254.7实验7：光合作用的暗-光诱导（Kautsky效应）......................................................284.8实验8：叶片的光-暗适应：I.快速诱导动力学的测量.............................................304.9实验9：叶片的光-暗适应：II.光响应曲线的测量...................................................325参考文献...............................................35叶绿素荧光与光合作用能量转换--叶绿素荧光基础实验指南2原作者序（UlrichSchreiber）如果能够通过学生自己操作的实验而将教科书上的知识传授给学生，并且实验过程还非常成功的话，那这种教学过程会令人很有成就感。而学生通过实验获取的知识也会记忆深刻，不会等考试时就已忘光了。光合作用是昀基本的生物学过程。它就发生在我们周围，与我们的日常生活息息相关。在植物生理学课程中，光合作用非常适合用来做示范和做实验。过去生物系的学生通常用沃伯格（Warburg）压力计和氧电极来测量光合作用。自从Kautsky效应被发现后，叶绿素荧光就被认为是一种令人印象深刻的现象，但也主要是以现象学存在。但在过去的10年中，人们已认识到叶绿素荧光不仅是做为一种现象而存在，随着测量技术的发展，已可以对荧光进行定量分析。因此，在许多研究领域，叶绿素荧光技术逐渐替代了传统的气体交换技术。随着TEACHING-PAM叶绿素荧光仪的发明，用于叶绿素荧光分析的复杂方法被简化并且重点突出了叶绿素荧光的基本知识，因此叶绿素荧光技术现在可以用于教学了。光合作用昀基本的反应就是在反应中心通过电荷分离而引起的原初能量转换，叶绿素直接参与了该过程，并且可以通过叶绿素荧光来反映该过程的效率。对于那些用惯了氧电极而未曾测量过叶绿素荧光的人，可能认为TEACHING-PAM荧光仪对于教学来说太复杂了。其实，该仪器的原理与操作均非常简单。仪器安装的时间不超过两分钟，并且不同提前调试。对实验材料没有特别限制，光合活性高和光合活性低的材料均可。数据在几秒种内就可获得，并且重复性极好。TEACHING-PAM需要连接电脑进行操作，仪器提供配套软件。荧光测量装置相对较小而且设计简单。氧电极的应用需要特殊附件（磁性转子、水浴、控制单元、记录仪、光化光源），并且需要准备电极（膜、极化）和样品（叶绿体或藻类）。荧光测量方法也考虑了这些因素，但相对较简单，并且出错的可能性更低。设计一种用于教学的叶绿素荧光仪的想法对我来说由来已久。在我与JörgKolbowski和Walz公司的密切合作下，终于实现了这个想法。这本小册子是对叶绿素荧光技术和光合作用能量转换的简介。我认为对初学者来说，在进行更复杂的应用前，首先熟悉相对简单的基础操作是很有必要的。我期望所有的TEACHING-PAM用户都能在迷人的叶绿素荧光和光合作用世界里找到乐趣。1996年11月于乌兹堡UlrichSchreiber叶绿素荧光与光合作用能量转换--叶绿素荧光基础实验指南31前言光合作用在任何植物生理学课程中都是重点章节。一方面光合作用属于植物的重要基础代谢过程，另一方面可以通过相对简单的教学实验来阐明光合作用。在乌兹堡大学的植物生理实验中，早期主要采用测量O2和CO2压强的方法，后来逐渐被极谱法测O2和红外吸收光谱法测CO2气体交换所取代。所有这些方法都有其优点并被广泛应用。然而，在教学实验中以上方法的成功应用取决于所用仪器是否经过授课教师的仔细调试。在教学实验中，往往是实验进行到一定程度后才发现所用仪器可能不在昀佳运行状态，可能存在不易当堂解决的问题，而这时实验时间已经所剩无几了。叶绿素荧光技术或许可以做为传统实验方法的一种替代或辅助方法。这种可替代性已在光合作用研究领域取得巨大成功，特别是自从饱和脉冲技术与脉冲调制叶绿素荧光仪（PAM）出现后。到目前为止，即使在教学实验中出现了叶绿素荧光技术，也经常是仅仅示范一下红色荧光和Kaustky效应（即样品暗适应一段时间后，照光时的典型荧光强度变化）。这种示范尽管非常简单，仅需要紫外灯和红色滤光片即可，还是深受学生欢迎。然而这种实验对于传授知识来说太简单了，现在需要更进一步，将叶绿素荧光与光合作用量子产量的定量关系传授给学生。尽管直到现在这种想法也未引起广大教师的足够重视，现状已经开始改变了。目前有关叶绿素荧光的理论基础和测定方法已相当完善，随着PAM荧光仪的发明，我们拥有了一个可靠的测量系统。叶绿素荧光与光合作用能量转换的效率之间有清晰的定量关系，而且这种关系并不复杂。基本法则很简单，符合热力学第一定律和爱因斯坦能量方程。当光被叶绿素分子吸收后，叶绿素分子由基态（低能态）跃迁到激发态（高能态）。激发态很不稳定，会释放能量回到基态。激发态分子释放能量的方式有3种：进行光合作用