ctDNA筛查癌症的挑战与困惑

ctDNA筛查癌症：思考与困惑南海区人民医院赵学峰NIPT检验中发现意外孕妇肿瘤450000例随访三年，其中79000例深度研究追查共计55例无法报告NIPT结果，40例孕妇证明存在肿瘤，18恶性、20例良性子宫纤维瘤、2例有影像学表现而未经病理证实孕妇NIP筛查获得意外肿瘤检验结果率1/万NileshG.Dharajiya,DanielS.Grosu,DanielH.Farkas.IncidentalDetectionofMaternalNeoplasiainNoninvasivePrenatalTesting.ClinicalChemistry64（2）：329–335(2018)4000例孕妇，发现3例癌症FrédéricAmant,PhD;MagaliVerheecke,MDIwonaWlodarsPresymptomaticIdentificationofCancersinPregnantWomenDuringNoninvasivePrenatalTesting.AMAOncology,2015：E1-E6我院：2017年有4例显示多重染色体异常，无追踪数据正常人13三体乳腺癌食道癌卵泡淋巴瘤术前术后NIPT的临床应用：6388例回顾分析258/6,388(4.04%)筛查阳性GrazianoPescia,NicolasGuex,ChristianIseli.Cell-freeDNAtestingofanextendedrangeofchromosomalanomalies:clinicalexperiencewith6,388consecutivecases.Geneticsinmedicine，2016ctDNA筛查胎儿异倍体的原理肿瘤发生所涉及的基因变化甲基化（SEPTIN9)点突变拷贝数变化转位与倒位ctDNA筛查需要考虑解决方案费用相对于cffDNA，ctDNA浓度满足吗？点突变的检测方法CNV的检测方法倒位与转位的检测方法ctDNA与组织DNA的一致性及敏感性、特异性全基因组测序Vs外显子测序Vs靶向panel测序点突变、CNV的异常是否具有临床意义？NGS到底要花多少钱？NGS到底要花多少钱？IlluminaNextSeq500,HiSeq4000,HiSeqX5平台全基因组测序：€1669；全外显子测序：€792靶基因组合测序€333包含了样本制备、测序、拼接非常依赖于技术熟练度，费用可相差2-5倍没有计算仪器投入、人工、场地、后勤支持等费用实际二代全基因组测序费用不低于5000美元/例NGS的工作流程测序深度测序深度：测序得到的碱基总量与基因组大小的比值测序深度与基因组覆盖度之间是一个正相关的关系测序带来的错误率或假阳性结果会随着测序深度的提升而下降测序深度与花费呈正比文库构建的作用对于NIPT，成本也是个重要因素ctDNA的生成与分类ctDNA浓度受肿瘤大小、位置、分期影响癌症早期ctDNA常1%，晚期约10%ctDNA概念：1–5ctDNA拷贝/ml外周血0.1%的ctDNA基本低于NGS测序得错误临界点胎儿ctDNA浓度与z评分、测序深度的关系Ai-huaYina,Chun-fangPeng.NoninvasivedetectionoffetalsubchromosomalabnormalitiesbysemiconductorsequencingofmaternalplasmaDNA.PNAS,2015（47）：14670–14675ctDNA%含量、基因覆盖度、CNV片段大小关系用CRISPR相关蛋白9系统富集低频突变的cfDNA切除、局部、转移肿瘤的ctDNA分布可根除局限性转移癌应用ctDNA作为肿瘤疗效与预后ctDNA在手术切除肿瘤得患者可以作为预后/复发指标在非手术切除肿瘤结论不一,从ctDNA来源考虑肿瘤化疗导致肿瘤细胞死亡，ctDNA增多（不反映恶化）肿瘤细胞自身凋亡导致ctDNA增多（不反应恶化）现实生活中难以不作治疗而静待ctDNA结果ctDNA与肿瘤组织DNA的检测一致性AmpliSeqCancerpanel(LifeTech):76%S.Xu,F.Lou,Y.Wu,D.Q.Sun,J.B.Zhang,W.Chen,etal.,CirculatingtumorDNAidentifiedbytargetedsequencinginadvanced-stagenon-smallcelllungcancerpatients,CancerLett.370(2)(2016)324–331.胰腺导管癌Kras检测：肿瘤组织阳性率91%，ctDNA80%羊水细胞沉淀DNA与羊水上清ctDNA得出100%相同结果造成不一致差异的原因ctDNA的产量ctDNA的质量是疾病真正不均一性的体现检测方法不足以敏感肿瘤是以点突变为主还是CNV为主MinKyeongKim,SangMyungWoo,BoramPark.PrognosticImplicationsofMultiplexDetectionofKRASMutationsinCell-FreeDNAfromPatientswithPancreaticDuctalAdenocarcinoma.ClinicalChemistry64:4726–734(2018)ctDNA检测肿瘤的实践（文献1）ctDNA检出率75%的中晚期肿瘤：胰腺癌、卵巢癌、结直肠癌、膀胱癌、胃和食管癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、头颈癌ctDNA检出率50%：原发脑癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌对于局部癌症：ctDNA检出率分别是73%（大肠癌）,57%（胃食管癌）,48%（胰腺癌）,50%（乳腺癌）对于大肠癌：ctDNA检测KRAS突变得敏感性87.2%、特异性99.2%应用ctDNA对肝细胞肝癌的检测(应用实例1）来自肿瘤的ctDNA片段较短85例A期肝癌和5例B期肝癌（巴塞罗那分期标准）研究表明：肝癌患者主要涉及1和8号染色体异常84%的肝细胞肝癌存在1或8号染色体CNV缺失或增多同时分析肿瘤组织和血浆ctDNA，取得63%的一致性肿瘤组织检出而ctDNA阴性（21%）：可能反映肿瘤小，ctDNA量少ctDNA检出而肿瘤组织阴性（15%）：反映肿瘤不均一性红色：CNV增多绿色：CNV缺失PeiyongJianga,CarolW.M.Chana,K.C.AllenChan.LengtheningandshorteningofplasmaDNAinhepatocellularcarcinomapatients.应用ctDNA对大肠癌的检测(应用实例2）特点：染色体臂水平的缺失主要发生在6,8p,14qand1p,拷贝数增多主要发生在19,5,2,9p和20p.敏感性86.8%、特异性56.3%检出5例I期患者CellPhysiolBiochem2018;45:1444-1454患者健康人群CNV的Z评分用于活动或恶性预测（黑色素瘤）CNV评分高于75th，预示活动病变ROC：0.9OR,46.7生存期：13.5月（75th）Vs73.8月（75th)肿瘤发生时的CNV变化CNV是癌症发生的因素之一26种癌症、3131病例，17%基因呈现扩增、16%缺失正常人群的扩增和缺失平均0.1-0.35%癌症人群中，25%呈染色体臂得扩增或缺失，10%是大小不等局部片段扩增或缺失每一局部片段不是扩增就是缺失，极少同时缺失或扩增局部CNV变化可有多至几十倍得扩增和最低两条等位基因缺失（0）染色体臂或整条染色体一般是3倍体扩增或单倍体缺失各种癌症患者中，最常发生CNV变异的是MYC扩增和CDKN2A/B缺失，总数占14%RameenBeroukhim，CraigH.Mermel，DalePorter，etal.Thelandscapeofsomaticcopy-numberalterationacrosshumancancers.NATURE|Vol463|18February2010NGS平台检出ctDNA的CNV能力假设目标片段仅存1个拷贝的增多或丢失10%ctDNA时：在1X基因组覆盖度.可检出1Mb的CNV1%ctDNA时：在3*基因覆盖度可见出30Mb大小的CNV0.5%ctDNA时：在3*基因覆盖度可检出-100Mb大小的CNV0.1%ctDNA时：在131X基因覆盖度可检出100Mb大小的CNV事实上癌症时，CNV增多常至少一个拷贝，检出能力理论上高于上述表述CNV检出率与测序深度、CNV片段大小在胎儿ctDNA检测得表现有创侵入获取DNA样本CGH法比NIPT准确在350万阅读深度，阳性率71.8%42of45(93.3%)的CNV5Mb35of35(100%)的CNV10Mb仅有14of34(41.2%)的CNV5Mb能被有效检出当测序阅读范围扩展到1000万时，敏感性提升至94.5%不同癌症类型CNV检出数量与CNV片段大小MolpariaB,NichaniE,TorkamaniA(2017)Assessmentofcirculatingcopynumbervariantdetectionforcancerscreening.PLOSONE12(7):e0180647.://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0180647至少一个CNV，5Mb至少一个CNV，100Mb2个CNV，5Mb2个CNV，100Mb100Mb：真阳性85.4%阳性预测值：99.7%5Mb：真阳性89.5%阳性预测值：99.5%CNV用于癌症组织起源的鉴别高分辨率（5Mb)与低分辨率（100Mb）CNV对组织起源鉴别无差异，而在于算法胰腺腺癌、前列腺癌和甲状腺癌难以区分组织起源无论高或低分辨率，对卵巢癌、乳腺癌,BRCA,GBMandKIRC的组织起源鉴别准确率95%对于鳞癌类如HNSC,LUSC、BLCA，提高分辨率能改进鉴别能力（准确度提升5%以上）鳞癌类LUSC,HNSC,ESCA和CESC的CNV相似，易于误分为同一种癌胃肠道肿瘤如STAD,COAD和READ，也易误分为同一种肿瘤其它学者的研究：CNV模式与癌症类型8例肺腺癌CTC，78%呈现一致CNV模式同一癌症的不同亚型其CNV模式差异（治疗方法启示）癌症患者治疗前后点突变基因此消彼长，但是CNV模式没有变化XiaohuiNi，MingleiZhuo.Reproduciblecopynumbervariationpatternsamongsinglecirculatingtumorcellsoflungcancerpatients.PNAS,2013（52）21083–21088肿瘤组织与血浆ctDNA检出CNV的差异靶向测序能减少成本吗？ctDNA样本检测CNV的困难外周血ctDNA量太少采用PCR预先扩增目标基因片段势在必行每一基因被打碎成100-200bp的片段，却无从得知断裂位置信息每一基因必须设计众多引物以覆盖目的基因PCR的扩增不均一性使得CNV计算不准确CNV多是染色体臂得变化，多个相邻基因同时变化得可信度？使用程序算法解决（ONCOCNV）ValentinaBoeva.Multi-factordatanormalizationenablesthedetectionofcopynumberaberrationsinampliconsequencingdata.BIOINFORMATICS，20414（30）：3443–3450EserKirkizlar的研