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2发酵工业菌种思考题1、常见的工业微生物包括哪些类群？2、作为工业生产菌株应具备哪些基本特性？3、了解发酵工业中的细菌、酵母菌、霉菌、放线菌及其生产的产品。4、掌握菌种分离筛选的基本过程。5、诱变育种及其原理。6、常用的化学诱变剂。7、菌种退化、原因与防治。8、菌种保藏的方法。常见的工业微生物：包括病毒、立克次氏体、细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、单细胞藻类、原生动物和支原体等。广义的微生物：细菌、放线菌、酵母菌、霉菌及危害细菌、放线菌生长的噬菌体等。一、工业微生物常用菌种1．细菌（bacteria）发酵工业常用的细菌有枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、乳酸菌、棒状杆菌、短杆菌等。用于生产酶制剂、醋酸、乳酸、氨基酸、肌苷酸等。2．放线菌(actinomyces)1）链霉菌属(Streptomyces)产生的抗生素：包括链霉素、新霉素、卡那霉素、妥布拉霉素、越霉素、春雷霉素、土霉素、金霉素、螺旋霉素、红霉素、麦迪霉素等。2）其它放线菌产生的抗生素：庆大霉素、利福霉素、指孢囊霉素、马杜拉霉素。3．酵母(yeast)酵母是单细胞真核微生物,具有典型的细胞结构,生长温度范围在4-30℃,最适温度为25-30℃。酵母在自然界分布很广，主要生长在偏酸性的含糖环境中。工业上常用的包括面包酵母、酒精酵母、啤酒酵母、葡萄酒酵母、假丝酵母、丝赤酵母等。用于酿酒、制造面包、生产脂肪酶、单细胞蛋白等。4．霉菌(mould)是一群在营养基质止形成绒毛状、网状或絮状菌丝真菌的通称。1）曲霉属(Aspergillus)黑曲霉（A.niger）：有多种活性强大的酶系，是酶制剂工业广泛应用的菌种之一。用以生产酸性蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、纤维素酶等，它的变异菌株可产生柠檬酸、葡萄糖酸、草酸及抗坏血酸。2）青霉属（Penicillium）产黄青霉：是青霉素的最重要生产菌，并能产生葡萄糖氧化酶及葡萄糖酸、柠檬酸、抗坏血酸等。展开青霉：主要用于生产抗真菌的抗生素－灰黄霉素。3）根霉属(Rhizopus)米根霉（Roryzae）：米根霉在我国酒药和酒曲中常见。其淀粉酶活力相当强，有淀粉糖化能力和转化蔗糖的性能，还能产生脂肪酶。能发酵产生乳酸、反丁烯二酸。华根霉：华根霉多出现在我国酒药和酒曲中，具较强的耐高温性能（45℃能生长），淀粉酶液化力强，有溶胶性，能产生酒精、芳香脂类、乳酸及反丁烯二酸，能转化甾族化合物。4）红曲霉属(Monascus)菌丝呈红色以至紫色，可由我国南方红曲中分离得到。5．其它担子菌：香菇、灵芝等。藻类：螺旋藻、单胞藻等。基因工程菌：基因工程菌在发酵工程已得到广泛应用，如酶制剂、胰岛素、干扰素、生长激素、乙型肝炎病苗等的生产。（1）能在廉价原料制成的培养基上生长，且生成的目的产物产量高、易于回收；（2）生长较快，发酵周期短；（3）培养条件易于控制；（4）抗噬菌体及杂菌污染的能力强；二、工业生产对菌种的要求（5）菌种不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定；（6）对放大设备的适应性强；（7）菌种为非病原菌，不产生任何有害的生物物质和毒素。三、发酵工业菌种的分离与筛选菌株分离（StrainSeparation)就是将混杂着各种微生物的样品按照实际需要和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。分离微生物新种的具体过程大体可分为采样、增殖、纯化和性能测定。采样原则：材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种。在一些极端环境（高温、高压、高盐等），可找到能适应苛刻条件的微生物类群。了解目标产物的性质和可能产目标产物的微生物种类及其生理特征，可提高效率，事半功倍。1、样品的采集2、样品的预处理目的：提高菌种分离效率。物理方法：热处理（用于减少样品中的细菌数）；膜过滤法和离心法（用于浓缩水中的微生物）；化学方法：通过在培养基中添加某些化学成分来增加特定微生物的数量。诱饵法：将一些物质（如石蜡、花粉、毛发等）加到待分离的样品中作诱饵富集目的菌。3、富集培养通过富集培养增加待分离的目标微生物的数量。控制培养基的营养成分：碳源或氮源；控制培养条件：温度、pH、渗透压、溶解氧浓度等。4、菌种分离平板划线分离法稀释分离法涂布分离法对菌株的筛选必须要有一个好的方法（最简单的方法）来加以鉴定，如颜色的变化、抑菌圈、透明圈等。5、菌种的筛选四、发酵工业菌种鉴定1、经典的分类鉴定方法形态学特征：生理生化特性：血清学试验与噬菌体分型：氨基酸顺序和蛋白质分析：2、现代分类鉴定方法DNA的碱基组成：核酸的分子杂交：遗传重组特性分析：rRNA序列分析：细胞化学成分特征分类法：五、发酵工业菌种改良菌种选育改良的目标：提高目标产物的产量；提高目标产物的纯度，减少副产物；改良菌种性状，改善发酵过程；改变生物合成途径，以获得高产的新产品。自然选育、诱变育种、抗噬菌体菌种的选育、杂交育种、原生质体融合技术、基因工程、蛋白质工程、代谢工程技术等都被用优良生产菌种的选育。菌株选育典型流程出发菌株（砂土管或冷冻管）小试原种特性考擦斜面或摇瓶培养24h培养基优化单孢子悬液菌悬液挑出高产菌株诱变处理摇瓶复筛处理前后计数稀释涂平板传种斜面观察单菌落形态挑选单菌落转种斜面保藏菌株对照组比较摇瓶初筛挑出高产斜面1、自然选育不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育（spontaneousmutation）。自然选育最为成功的例子是目前被广泛使用的卡介苗(BCGvaccine)。法国的卡尔密脱(Calmette)和介林(Guerin)把牛型的结核分枝杆菌接种在牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上，连续传代培养230代，前后经历13年时间，终于在1923年获得显著减毒的结核杆菌----卡介苗。2、诱变育种诱变育种是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究用。物理诱变剂物理诱变主要是采用辐射。如紫外线、X射线、γ射线、激光和快中子等都是常用的物理诱变剂。化学诱变剂常用的化学诱变剂根据其作用方式不同分为三种类型。(1)与核酸碱基化学反应的诱变剂此类型主要有烷化剂、亚硝酸和羟胺等。常见的烷化剂有硫酸二乙酯(EDS)、甲基磺酸乙酯(EMS)、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、亚硝基甲基脲(NMU)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙酸等。碱基中的鸟嘌呤最易受烷化剂作用，形成6-烷基鸟嘌呤，并与胸腺嘧啶错误配对，造成碱基转换。胸腺嘧啶被烷基化后，可与鸟嘌呤错误配对。(2)碱基类似物这些化合物有5-溴尿嘧啶(5-BU)，5-氟尿嘧啶(5-FU)、8氮鸟嘌呤(8-NG)和2-氨基嘌呤(2-AP)等。它们与碱基的结构类似，在DNA复制时，它们可以被错误地掺入DNA，引起诱变效应，所以说它们引起碱基置换的作用是间接的。(3)移码突变的诱变剂移码突变是指由一种诱变剂引起DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的插入或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和翻译错误的一类突变。由移码突变产生的突变体称为移码突变体。吖啶类染料(原黄素、吖啶黄、吖啶橙及α-氨基吖啶等)和一系列称为ICR类的化合物(它们是一些由烷化剂与吖啶类化合物相结合的化合物)都是移码突变的有效诱变剂。3诱变育种方法1）出发菌株的选择自然界直接分离到的野生型菌株经历过生产条件考验的菌株已经历多次育种处理的菌株2）制备菌悬液3）诱变处理剂量确定预试验诱变育种中还常常采取诱变剂复合处理，使它们产生协同效应。复合处理可以将两种或多种诱变剂分先后或同时使用，也可用同一诱变剂重复使用。因为每种诱变剂有各自的作用方式，引起的变异有局限性，复合处理则可扩大突变的位点范围，使获得正突变菌株的可能性增大，因此，诱变剂复合处理的效果往往好于单独处理。诱变剂复合处理及其协同效应菌种单独处理复合处理诱变剂突变率(%)诱变剂突变率(%)土曲霉紫外线X射线21.319.7紫外线+X射线42.8土曲霉氮芥(0.1%)紫外线不明显4.7紫外线+氮芥11.0链霉菌紫外线γ射线31.035.0紫外线+γ射线43.6金色链霉菌(2U-84)二乙烯三胺硫酸二乙酯紫外线6.061.7812.5紫外线+二乙烯三胺紫外线+硫酸二乙酯26.635.86灰色链霉菌(JIC-1)紫外线9.8紫外线+可见光照射1次紫外线+可见光照射6次9.716.64、杂交育种杂交育种(Hybridization)一般是指人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，或原核微生物的接合、F因子转导、转导和转化等过程，促使两个具不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。5、原生质体融合技术6、基因工程育种7、蛋白质工程育种定点突变技术定向进化技术8、代谢工程育种9、反向生物工程育种六、发酵工业菌种的复壮与保藏（一）工业生产菌种的退化现象及原因菌种退化（degeneration）主要指生产菌种或选育过程中筛选出来的优良菌株，由于连续传代或保藏之后，群体中某些生理和形态特征逐渐退化或完全丧失（包括菌株产孢子能力、发酵主产物产量下降）的现象。1、退化的表现菌落和细胞形态的改变：如苏云金芽孢杆菌的芽孢和伴孢晶体变得小而少；生长速度缓慢，产孢子越来越少：如细黄链霉菌的菌苔变薄、生长缓慢，不再产生典型而丰富的橘红色分生孢子层；抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温等）能力的减弱。代谢产物生产能力下降：如藤仓赤霉产赤霉素能力下降；2、退化的原因1）基因突变那些控制生产性状的基因发生负突变。2）分离现象由于诱变获得的高产菌株本身不纯，高产突变只发生在一个核（多核时）和一条DNA链上（单核时），随着细胞分裂，核发生分离，突变基因和未突变基因发生分离，出现了突变的高产菌株和未突变的低产菌株。3）自发突变培养环境营养不良、发酵时间过长而积累有害产物都会加快菌种退化。3、菌种退化的防治1）从菌种选育方面考虑在育种过程中，应尽可能使用孢子或单核菌株，避免对多核细胞进行处理；在使单链突变的同时，使另一条单链丧失模板作用，以减少出现分离回复现象；诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化，以保证菌株的“纯度”。2）控制传代次数如产腺苷的芽孢杆菌黄嘌呤营养缺陷型菌株，回复子的比例随传代次数的增加而增加，腺苷产量也随之下降。3）创造良好的培养条件在进行栖土曲霉培养时，温度从28-30℃提高到33-34℃，可防止产孢子能力的衰退。4）利用不易衰退的细胞传代在放线菌和霉菌中，由于其菌丝细胞常含有几个细胞核，若用菌丝接种就易出现衰退，而孢子一般是单核的，用于接种，就不会发生这类现象。有些霉菌如用其分生孢子传代易于衰退，而改用其子囊孢子接种，则能避免退化。5）采用有效的菌种保藏方法1、纯种分离法在衰退菌种的细胞群中，一般还存在仍保持原有性状的个体，设法对其进行分离纯化。（二）、工业生产菌种的复壮2、淘汰已衰退的个体采用高温或低温及其方法淘汰衰退的个体。3、选择合适的培养条件如平菇菌种在PDA培养基上连续传代会导致菌种衰退，而在PDA综合培养基（PDA中添加维生素和蛋白胨等）中培养则能使衰退的菌种复壮。（三）工业生产菌种的保藏菌种保藏的意义：保持菌种优良性状的稳定，满足生产需要。菌种保藏的基本原理：根据微生物的生理生化特性，人为地创造条件，使微生物处于代谢不活泼、生长繁殖受到抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。一般可通过降低培养营养成分、低温、干燥和缺氧等方法，达到防止突变、保持纯种的目的。2．穿刺保藏法：常用于保藏各种需气性细菌。1．斜面保藏法这是一种最基本的方法，适用范围广，细菌、真菌和放线菌都可应用。3．沙土管干燥保藏法：这种方法适用于形成芽孢的细菌、形成孢子的丝状真菌和放线菌。其原理是将微生物吸附在各种载体上，干燥后保藏。4．冷冻干燥保藏法：其基本原理是将微生物或孢子冷冻，然后在减压的情况下使水分升华，使细胞的代谢、生理等生命活动处在停止状态下长期保藏。5．液氮保藏法：其方法是将浓的悬液加入灭菌后的分散剂中，细菌加入最终浓度为10%的甘油或5%二甲