发酵工程3

发酵工程(3)6.5发酵工程的下游技术•从发酵液中分离、纯化目的产物的过程称为下游加工工程（downstreamprocessing）。这一过程由一些化学工程单元组成。•这一过程在整个生产中所占成本较高，传统发酵工厂中占总投资的60%；重组蛋白生产企业这部分费用占生产费用的80%——90%。6.5.1发酵工程下游技术概论1.特点：①产物在初始料中含量较低,而产品要求纯度高、无菌、无热原；②含有大量细胞及代谢产物；③产物稳定性差，易失活变性；④产物的种类繁多、结构不一、活性各异；⑤代价昂贵,回收率低。几种产品在发酵液中的浓度产品典型浓度（g/L）抗生素25氨基酸100酒精100有机酸100酶20蛋白质106.5.1发酵工程下游技术概论2.建立分离纯化工艺的根据发酵产物其上游过程的各种因素对分离、纯化工艺有影响。包括：①菌种的类型及其代谢特性。②原材料培养基的来源及其质量。③物料中杂质的种类和性质。④生产工艺及条件。⑤目的产物特性。⑥产品质量的要求•3.一般程序(1).预处理和固液分离：加速固液相分离(2).细胞破碎分离胞内产物(3).初步纯化（提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质(4).高度纯化（精致）：除去与产物性质相似的杂质(5).产品加工生物产品分离纯化的一般步骤发酵液或培养液细胞产物胞外产物胞内产物离心或过滤细胞（洗涤）离心或过滤（洗涤)离心或过滤（洗涤）细胞破碎（化学法机械法等）整体细胞萃取离心、过滤干燥分离剂回收、再生提取、分离沉淀、吸附、萃取、过滤等分离剂回收、再生纯化、精制层析、结晶、电泳等干燥废物产物产物滤液循环副产物废物滤渣副产物循环废物细胞滤渣副产物废物细胞含产物的清液预处理阶段4.分离纯化的技术①技术条件温和能保持产物生物活性。②选择性好，能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离，达到较高的纯化倍数。③收率要高。④两个技数间能直接衔接,不需要对物料加以处理。⑤纯化过程要快，满足高生产率的要求。6.5.2发酵液的预处理和固液分离方法1.发酵液的预处理细菌及某些放线菌菌体细小，发酵液粘度大，不能直接过滤.由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它有机粘性物质的存在会造成滤液浑浊，滤速极慢。在预处理中应采用絮凝或凝聚的方法，设法增大悬浮液中固体粒子的大小，提高其沉降速度，或采用稀释、加热等方法降低粘度，以利于过滤。分离菌体和其它悬浮颗粒去除部分可溶性杂质改变滤液的性质发酵液中杂质很多，其中对提炼影响最大的是高价无机离子（Ca＋＋、Mg十＋、Fe＋＋）和杂蛋白质等。高价无机离子的存在，会影响树脂对生化物质的交换容量。杂蛋白质的存在，不仅在采用离子交换法和大网格树脂吸附法提炼时会降低其吸附能力，而且在采用有机溶剂或两水相萃取时，容易产生乳化，使两相分离不清，在预处理时，应尽量除去这些物质。1)高价无机离子的去除方法为去除钙离子，宜加入草酸的可溶性盐，如草酸钠。反应生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固，提高滤液（也称为原液）质量。要除去镁离子，可以加入三聚磷酸钠，它和镁离子形成可溶性络合物：Na5P3O10＋Mg＋＋＝MgNaNa3P3O10＋2Na十用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。要除去铁离子，可加入黄血盐，使形成普鲁士蓝沉淀。2)杂蛋白质的去除方法蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。(1)调pH值蛋白质在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。因为羧基的电离度比氨基大，故蛋白质的酸性性质通常强于碱性，因而很多蛋白质的等电点都在酸性范围内（pH4.0－5.5）。但单靠调节pH至等电点的办法不能将大部分蛋白质除去。在酸性溶液中，蛋白质能与一些阴离子如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；在碱性溶液中，能与一些阳离子，如Ag十，Cu＋＋，Zn十十，Fe＋＋和Pb＋＋等形成沉淀。(2)加热处理:变性蛋白质溶解度较小。最常用的使蛋白质变性的方法是加热。加热还能使液体粘度降低，加快过滤速度。该法只适用于对热较稳定的生化物质。（3）加入使蛋白变形的有机溶剂加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等使蛋白质凝固。加有机溶剂使蛋白质变性的方法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。（4）利用吸附作用除去蛋白四环类抗生素生产中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾K2Zn3〔Fe（CN）5〕2的胶状沉淀来吸附蛋白质。在枯草杆菌发酵液中，常加入氯化钙和磷酸氢二钠，这两者本身生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去，从而加快了过滤速度。（5）加入絮凝剂，使可溶性蛋白质胶体凝聚或絮凝凝聚和絮凝技术能有效地改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使聚集起来，以便于过滤，常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理中。凝聚是在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。常用Al2（SO4）3·18H2O（明矾）；AlC13·6H2O；FeC13；ZnSO4；MgCO3等絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。目前最常见的高分子聚合物絮凝剂是聚丙烯酰胺类衍生物。3）去除色素及其它物质(1).色素产生微生物生长代谢产生，培养基带来(2)去除方法离子交换剂、离子交换纤维、活性炭等吸附如DEAE-纤维素从含酶溶剂中吸附色素物质时，可同时去除非活性蛋白质序号方法原理设备1絮凝利用电荷中和及大分子桥联作用形成更大的粒子2离心在离心产生的策略场作用下，加快颗粒的沉降速度高速冷冻离心机蝶片式离心机管式离心机倾析式离心机筐式离心机3过滤依据过滤介质的空隙大小进行分离板框过滤机平板过滤器真空旋转过滤机管式过滤器蜂窝式过滤器深层过滤器4膜分离依据被分离的分子大小和膜孔大小进行分离平板、卷曲、中空纤维、管式微孔过滤器平板、卷曲、中空纤维，管式超滤器平板渗透器半透膜型、离子半透膜型电渗析器2.发酵液的过滤和离心微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余的固体培养基成分。过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒与液体进行分离的过程。(1)影响过滤速度的因素过滤速度和菌种、发酵条件（培养基的组成，未用完培养基的数量，消沫油，发酵周期）等有关。菌种对过滤速度影响很大。一般，真菌的菌丝比较粗大，发酵液容易过滤，常不需特殊处理。其滤渣呈紧密饼状物，很容易从滤布上刮下来，故可采用鼓式真空过滤机过滤。放线菌发酵液菌丝细而分枝，交织成网络状。还含有很多多糖类物质，粘性强，过滤较困难，一般需经预处理，以凝固蛋白质等胶体。细菌发酵液的菌体更细小，因此，过滤十分困难，如不用絮凝等方法预处理发酵液，往往难以采用常规过滤的设备来完成过滤操作。培养基的组成对过滤速度影响也很大。用黄豆粉、花生粉作氮源、淀粉作碳源会使过滤困难。此外，发酵后期加消沫油或剩余大量未用完的培养基，都会使过滤困难。正确选择发酵终了时间对过滤影响很大。在菌丝自溶前必须放罐，因为细胞自溶后的分解产物一般很难过滤。有时延长发酵周期虽能使发酵单位有所提高，但严重影响发酵液质量，使色素和胶状杂质增多、过滤困难，最终造成成品质量降低。(2)改善过滤性能的方法采用等电点，蛋白质变性、吸附以及凝聚和絮凝等方法预处理发酵液，以改变发酵液的性状和过滤性能。除此以外，改善过滤性能的方法还有：加入助滤剂，直接在发酵液中形成填充－凝固剂、媒介作用等。改善过滤性能较好的方法是加入一些反应剂，它们能相互作用，或和某些溶解性盐类发生反应生成不溶解的沉淀。生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身即可作为助滤剂，并且还能使胶状物和悬浮物凝固。如发酵液中有不溶解的多糖存在，则最好用酶将它转化为单糖，以提高过滤速度。加入淀粉酶后，能使过滤速度加快。发酵液染菌后，会含很多细菌菌体，杂质也增多，给边滤造成很大困难。处理方法有：升高温度，增加纯化剂用量、加助滤剂等。•①常压过滤靠悬浮液的液位差来进行过滤的，推动力的大小由液位高决定，麦芽法过滤槽和沙滤即属此类设备。推动力不大，过滤缓慢，生产能力低。但设备简单，滤液质量稳定，对于生产能力不大厂的或固体含量小而易过滤的悬浮液仍然采用。•②加压过滤它是利用压缩空气或往复泵、离心泵等输送悬浮液所形成的压力作为过滤的推动力。在待过滤悬浮液中，固形物含量为50%左右，而要求滤液较清亮的情况下都可采用这种方法过滤。由于加压过滤的推动力大，所以过滤速度快，适用于滤液黏度大、颗粒度细、可压缩性的各类物料，如发酵液的除菌便可用此法。板框过滤机、气压式过滤机和加压叶片过滤机等都属于这一种。(3)常用的过滤方法•③.真空过滤在过滤介质的滤液一侧建立适当的真空，以增大推动力，压力差通常不超过8.34×104Pa，使滤液通过过滤介质，固体微粒滤机，真空叶片过滤机等，可用于某些发酵液如柠檬酸发酵液的除菌处理。•④.离心过滤此类设备有三足式离心机等、锥兰式离心机、活塞浆冲卸料离心机等。对于一些高度分散的悬浮液或悬浊液(由两种重度相近的液体组成)，如酵母液和氨基酸发酵液的菌体分离可用高速离心机或超高速离心机，如酵母分离机、管式离心机等。碟式离心机结构及工作原理进料轻液出口菌体及固体杂质干燥处理机械法非机械法固体剪切作用流体剪切作用破碎方法溶胞处理珠磨法压榨法超声法化学法物理法高压匀浆酶溶法3、细胞的破碎细胞破碎就是通过采用不同手段破坏细胞外围使细胞内含物释放出来，转入液相中，以便于进行产物的分离纯化。细胞破碎的方法有很多，按照是否存在在外加作用力可分为机械法和非机械法两大类。细胞破碎方法序号方法原理设备特点缺点1压力破碎法利用压力释放时的液固剪切进行破碎压力破碎机操作简便，可连续操作，适用于不同的细胞加压放热，需要冷却，否则生物活性物质会失活；破碎率较低，压力不稳定，需要进行反复破碎2珠磨破碎法利用固体的剪切进行破碎细胞珠磨破碎机操作简便、稳定，可连续批式操作，破碎率可以控制，容易放大，适用于工业放大珠磨时会放热，需要高效冷却，不同细胞的破碎条件差异大3超声波破碎法利用超声波形成空穴产生压力冲击使进行破碎超声破碎机操作简便，可连续或批式操作超声波处理会产热，需要冷却，破碎率较低，需反复进行破碎，应用面较窄4渗透压法利用渗透压的突变，造成细胞内压力差而引起细胞的破碎适用于位于胞内质的产物释放，细胞的破碎率低，但产物的释放较好，纯度较高操作比较复杂，条件要求严格，只适用于少量榈的处理，费用高5有机溶剂或表面活性剂法利用有机溶剂或表面活性剂改变细胞壁或膜的通透性，使胞内产物得以释放方法简单，细胞内含物释放少，产物较纯，可大规模应用适用性有限，只适合于对有机溶剂或表面活性剂稳定的产物6碱或酶处理法经碱或酶的处理使细胞壁或膜破坏，使产物释放出来方法简单，可大规模应用适用性有限，只适合于对碱或酶稳定的产物JJ-2组织捣碎匀浆机Ultrasonication超声波超声波破碎仪WSK卧式高效全能珠磨机Crushinginballmill珠磨法ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机6.5.3、发酵产品的分离纯化方法发酵产物的提取和精制过程也就是浓缩和纯化过程，其中第一步操作从发酵液中分离提取发酵产物最为重要，称为提取。而以后几步操作所处理的体积小了，操作要容易些，主要将发酵产物部分除去杂质、浓缩、提纯及精炼，这过程统称精制。用于生物物质分离、纯化的方法除了传统的沉淀法、吸附法、离子交换、萃取法等之外，还有超滤、反渗透、电渗析、凝胶电泳、离子交换层析、新和层析、疏水层析、等电聚焦、双水相萃取、超临界萃取、反胶团萃取、凝胶层析等。工业生产工艺中的分离纯化步骤:总是将最容易分离的物质放在前面，而将难以分离的物质留在后面进行分离。一般第一步应当是非特异性的低分辨率的分离技术，如沉淀、粗的吸附.第二步采用高分辨、较高选择性的分离技术.最后选择兼有高选择性分离纯化、又有澄清、脱盐等作用的凝胶层析.1、分离纯化工艺应遵循的原则1）具有良好的稳定性和重复性；2）尽可能减少组成工艺的步骤；3）组成工艺的各技术或步骤之间要能相互适应和协调,工艺和设备相适应。4）在工艺过程中尽可能少用试剂，以免增加分离纯化步