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第八章第八章氨氨基基酸酸一、氨基酸及生产概述一、氨基酸及生产概述二、谷氨酸及味精的生产二、谷氨酸及味精的生产三、赖氨酸的生产简介三、赖氨酸的生产简介一、氨基酸及生产概述1、氨基酸的基本特性氨基酸是组成蛋白质的基本单位，常由C、H、O、N、S五种元素组成H2NCHCOOHRα羧酸分子中的α－C的一个氢原子被NH2取代而成的化合物，故称α－氨基酸除甘氨酸（R＝H）无不对称C原子外，其它α－C均为不对称C，都有D－型和L－型之分以L－甘油醛和L－乳酸为参考，α－C上构型与L－甘油醛和L－乳酸相同为L－型氨基酸，其余为D－型氨基酸大约20种的L－型氨基酸构成庞大的各种肽类、蛋白质和生命体8种必需氨基酸（L－型）：赖氨酸Lys、苏氨酸Thr、亮氨酸Lcu、异亮氨酸Ilc、苯丙氨酸Phe、色氨酸Try、蛋氨酸Met、缬氨酸ValD－氨基酸在细菌细胞壁、肽类抗生素和植物中发现2、氨基酸的应用基于其营养价值、风味、生理学活性和化学特性，估计全世界氨基酸市场约为40～50亿美元，约35%用于食品，50%用于饲料，15%用于医药和治疗1）食品方面的应用氨基酸，特别是必需氨基酸，赖氨酸、蛋氨酸常作为添加剂，提高营养价值自然芳香的前体，能增加食品的风味，在食品工业作为风味添加剂，还可以作为调品、防腐、保鲜等方面氨基酸不同的呈味甜味：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺等苦味：亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸酸味：谷氨酸、天冬氨酸鲜味：谷氨酸钠、天冬氨酸钠不同的呈味使氨基酸在食品中的应用极其广泛二肽和寡肽大多具苦味，阿斯巴甜Aspartame（L-天冬氨酰－L-苯丙氨酸甲酯）是个例外，比蔗糖甜150～200倍，人造甜味剂，用于低卡路里饮料，年产量超过2万吨2、医药方面的应用¾氨基酸构成蛋白质、参与体内代谢和各种生理机能，维持蛋白质的动态平衡¾通过输液治疗各种营养或代谢失调、术前术后的营养剂¾医疗功效：精氨酸－氨中毒的肝昏迷，天冬氨酸钾镁－消除疲劳、心力衰竭、肝脏疾病，蛋氨酸、胱氨酸治疗脂肪肝，谷氨酸和谷氨酰胺治疗脑出血后的记忆力障碍等等¾氨基酸螯合铁、钙等金属离子作补铁剂、补钙剂3）饲料方面的应用促进动物生长发育，改善肉质，提高产奶、产蛋量，节省蛋白质饲料，使饲料得到充分利用，降低成本氨基酸作为单胃动物的营养，极大的扩大了氨基酸市场，组成蛋白质的氨基酸几乎有半数对于动物（如生猪和家禽）来说是必需的鱼粉、大豆、小麦、玉米蛋白等等天然饲料都缺乏蛋氨酸、赖氨酸和苏氨酸，而家禽对这些限制性氨基酸需求是相当高的，目前DL-蛋氨酸和L-赖氨酸年产量分别35万吨、40万吨，L-苏氨酸成功进入饲料市场4）农业方面的应用氨基酸及其金属盐类或聚合物、衍生物可做杀虫剂、除草剂、脱叶剂、杀菌剂等等氨基酸本身并无杀菌作用，被植物吸收也不能合成有杀菌作用的化合物，但能干扰植物和病原菌的生化关系，使植物代谢和抗病性能发生改变，达到抑菌的目的苯丙氨酸、丙氨酸对苹果疮痂病有效，丝氨酸、苏氨酸对黄瓜的疮痂病有效5）化工方面的应用胱氨酸用于护发素，丝氨酸用于面霜，甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸与脂肪酸制造表面活性剂，具有清洗、杀菌功能，用于护肤品、洗发剂酰基－L－谷氨酸钠为表面活性剂聚谷氨酸树脂具有天然皮革性能，可用于制造耐季节变化的人造皮革和涂料3、氨基酸的生产方法1）蛋白质酸水解法1820年开始以毛发、血液、废蚕丝等酸水解，现代用豆粕（饼）、淀粉糖渣、玉米浆等原料水解生产的氨基酸种类多，但得率低，浪费大，环境污染严重2）化学合成法20世纪50年代，随着石油化工的发展，利用有机合成和化学工程结合的技术生产或制备氨基酸，如甘氨酸、DL-蛋氨酸、DL-丙氨酸等氨基酸品种上不受限制，除制备天然氨基酸，还可以制备非天然氨基酸DL-型均有，需要拆分，安全性无定论3）酶法微生物特定酶做催化剂，使底物催化生产所需氨基酸，能用酶法生产的氨基酸有10多种，如L-丙氨酸、L-色氨酸、L-丝氨酸酶法生产氨基酸具有工艺简单、周期短、能耗低、专一性强、收率高的特点应用受限制：如何获得廉价的合成底物和微生物酶是这一方法的关键4）发酵法添加前体发酵法又称微生物转化法，用葡萄糖做发酵碳源，添加前体物质，避免氨基酸合成途径的反馈抑制作用，经微生物作用有效的转化为目的氨基酸，如以甘氨酸为前体生产丝氨酸直接发酵法借助微生物具有合成自身需要的氨基酸的能力，通过对菌株诱变、代谢过程调节，选育出各种营养缺陷型或抗性突变株，解除代谢调节中的反馈抑制和阻遏，达到大量合成并积累某种氨基酸应用此法生产量昀大是谷氨酸，其次是赖氨酸，20余种天然氨基酸除胱氨酸、半胱氨酸，都能用此法生产1956年，木下祝郎Kinoshita首次报道分离出谷氨酸生产菌产谷氨酸小球菌Micrococcusglutamicus，后重新鉴定为Corymebateriumglutamicum次年发酵法工业生产谷氨酸首先在日本问世，继而掀起了氨基酸研究的热潮世界上主要的氨基酸生产企业日本味之素公司（Ajinomoto）日本协和发酵公司（KyowaHakko）德国Degussa公司美国ADM公司氨基酸发酵属于典型的代谢控制发酵，因为氨基酸的生物合成受到严格的反馈调节，进行氨基酸发酵，必需采取人为手段打破微生物的反馈调节机制，从而大量积累目的氨基酸经几十年的努力，不但阐明了20多种氨基酸的生物合成途径，而且找到解除这些调节机制的办法4、代谢调节工业发酵的目的：大量积累人们所需要的微生物代谢产物代谢的人工控制：人为地打破微生物的代谢控制体系，使代谢朝着人们希望的方向进行人工控制代谢的手段：改变微生物遗传特性(遗传学方法）控制发酵条件（生物化学方法）改变细胞膜透性在正常生理条件下微生物通过其代谢调节系统吸收利用营养物质用于合成细胞结构，进行生长和繁殖，它们通常不浪费原料和能量，也不积累中间代谢产物代谢的人工控制人为地打破微生物的代谢控制体系，就有可能使代谢朝着人们希望的方向进行营养缺陷型菌株的应用末端产物E对生长乃是必需的，所以，应在培养基中限量供给E，使之足以维持菌株生长，但又不至于造成反馈调节（阻遏或抑制），这样才能有利于菌株积累中间产物C对于直线式代谢途径：选育营养缺陷性突变株只能积累中间代谢产物AaBbCcDdE分支代谢途径：情况较复杂，可利用营养缺陷性克服协同或累加反馈抑制积累末端产物，亦可利用双重缺陷发酵生产中间产物ABCDEFG各图成立的条件：1.限量添加E；2.限量添加E；3.限量添加E和G；4.限量添加E和G；5.限量添加I“┄”表示营养缺陷突变位置；“≠”表示反馈调节解除要根据其不同反馈控制机制抗反馈控制突变株的应用★抗反馈控制突变株——是指对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性，或两者兼有之的菌株★抗反馈控制突变株可以从终产物结构类似物抗性突变株和营养缺陷性回复突变株中获得目标产物结构类似物赖氨酸S-（2氨基乙基）-L半胱氨酸-(AEC)苏氨酸α-氨基-β-羟基戊酸（AHV)异亮氨酸乙硫氨酸精氨酸D-精氨酸苯丙氨酸对氟苯丙氨酸二、谷氨酸及味精的生产L-谷氨酸是生物体内氮代谢昀重要的氨基酸之一，是连接氮代谢和糖代谢的氨基酸。L-谷氨酸一钠，俗称味精，具强烈的鲜味，作调味品，广泛用于烹饪和食品加工早期谷氨酸的生产水解小麦面筋、大豆蛋白、制糖废液等，1957年日本开始采用微生物发酵法生产谷氨酸获得成功，目前谷氨酸钠产量100多万吨，约占氨基酸总产量的1/2，不仅在氨基酸工业，在发酵工业也令人瞩目我国1923年开始水解法生产氨基酸，1964年开始发酵法生产谷氨酸1、谷氨酸生产菌棒状杆菌属(Corynebacterium)短杆菌属(Brevibacterium)小杆菌属（Microbacterium）节杆菌属(Arthrobacter)共同点1）革兰氏阳性、不形成芽孢2）没有鞭毛、不能运动3）都是需氧型4）多为生物素缺陷型5）具有过量合成谷氨酸的能力国内常用菌株：北京棒杆菌AS1.299、7338、S-941、D110钝齿棒杆菌AS1.542、HU7251、B9天津短杆菌T6-13、FM-8207、U-9、TG-3、TG-866、D852、发酵机制谷氨酸的生物合成途径包括糖酵解途径（EMP）、己糖磷酸途径（HMP）、羧化反应（CO2固定）、三羧酸循环（TCA）、乙醛酸循环（DCA），生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸还原氨基化生成谷氨酸C6H12O6+NH3+2/3O2C5H9O4N+CO2+3H2O理论转化率：147/180×100%＝81.7%菌体生长、副产物的生成、生物合成耗能，实际产率低于理论转化率细胞膜透性的控制谷氨酸合成过程的畅通与酶活性的调节适当时对谷氨酸发酵很重要，但细胞膜对谷氨酸的透性更重要磷脂由不饱和脂肪酸、甘油、磷酸和侧链组成①生物素缺陷型限制生物素量，限制不饱和脂肪酸的合成，使磷脂减少，细胞膜不完整生物素缺陷型的生成菌可以添加表面活性剂或青霉素②油酸缺陷型阻断不饱和脂肪酸的合成，限制供给量，限制磷脂合成③甘油缺陷型阻断甘油合成，限制供给量，限制磷脂合成④温度敏感突变株温度敏感株在合成期改变发酵温度，也能大量分泌谷氨酸⑤其它突变株许多营养缺陷型、抗药性突变株和敏感性突变株的谷氨酸产量比出发株高由葡萄糖发酵谷氨酸的理想途径谷氨酸合成的理想途径CO2固定酶系活力强Citratesynthase,Aconitase,ICDH,GDH酶活力强乙醛酸循环弱异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱α-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱谷氨酸脱氢酶能力强3、育种⑴脲酶强阳性⑵不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白以及明胶等⑶发酵中菌体发生明显的形态变化，同时发生细胞膜渗透性的变化⑷异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱、乙醛酸循环弱⑸α-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱⑹还原性辅酶Ⅱ（NADP）进入呼吸链的能力弱⑺柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶活力强⑻二氧化碳固定反应酶系活力强1）共性规律菌种选育根据谷氨酸的生物合成途径和代谢调节机制：解除反馈调节、切断或减弱支路代谢、增加前体物合成、提高细胞膜透性等要点考虑耐高渗透压，20～30%葡萄糖平板、15~20%味精平板生长好除诱变育种外，原生质体融合、转化、转导、重组DNA技术都有应用4、发酵环境影响当环境条件发生变化时，菌体的生物代谢也会发生变化，谷氨酸发酵会向其他发酵转换，谷氨酸积累减少，而其他副产物积累量增加溶氧适中不足过量产生谷氨酸产生乳酸产生α-酮戊二酸磷酸盐适中过量产生谷氨酸产生缬氨酸NH4适中不足过量产生谷氨酸产生α-酮戊二酸产生谷氨酰胺生物素适量过量产生谷氨酸乳酸琥珀酸pH适宜过高产生谷氨酸谷氨酰胺、N-乙酰谷氨酸原料预处理配料补料（液氨、糖）斜面种子摇瓶种子种子罐发酵罐提取空气净化系统5、发酵工艺1）工艺流程2）种子制备举例斜面种子培养培养基：葡萄糖0.1%蛋白胨0.1%牛肉膏0.1%NaCl0.5%琼脂2～2.5%pH7.0～7.2培养条件：7338/B930~320C、T6－1333～340C18~24h要求：菌种绝对纯、一般只移种3代避免自然变异引起的退化，经常对菌株进行分离纯化一级种子培养培养基：葡萄糖2.5%尿素0.5%MgSO40.04%K2HPO40.1%玉米浆2.5～3.5%FeSO42ppmMnSO42ppmpH7.0培养条件：200ml/1000ml三角瓶，温度同斜面培养，12h要求：pH6.4±1O.D净增0.5以上残糖0.5%无菌检验（－）噬菌体检验（无）镜检菌体生长均匀、粗壮、排列整齐、革兰氏阳性有的将一级种平板检查确认无杂菌和噬菌体感染才使用二级种子培养培养基：水解糖2.5%玉米浆2.5～3.5%K2HPO40.15%MgSO40.04%尿素0.4%Fe2+2ppmMn2+2ppmpH6.8～7.2培养条件：种量0.8～1.0%温度同一级种7～8h风量：50L1：0.5340rpm250L1：0.3300rpm500L1：0.2230rpm要求：pH7.2左右O.D净增0.5残糖1%左右无菌检查（－）噬菌体检验（无）镜检：生长旺盛、排列整齐3）发酵间歇发酵低糖发酵（10～12%）发酵周期36