发酵工程第8章发酵过程控制

第八章发酵过程控制第三节PH对发酵的影响及控制主讲人:李文涵2015/04/14pH是表征微生物生长及产物合成的重要状态参数之一，也是反映微生物代谢活动的综合指标。又影响代谢的进行，所以是十分重要的参数。掌握发酵过程中PH的变化规律，以便在线适时监控，使其一直处于生产的最佳状态水平。三、最适pH的选择四、PH的调控策略一、发酵过程中的pH变化及其原因二、pH对发酵的影响1.在微生物细胞的生长阶段:初期:接种后到孢子萌发,因碳氮源代谢水平比较低,pH一般可维持不变,或者由于添加了CaCO3而略有上升。快速生长期：pH值变化较大，因菌种及培养基不同而上升或下降。2.在生产阶段，一般发酵液的pH值趋于稳定，维持在适合产物形成的pH范围。3.在微生物细胞自溶阶段,养分的耗尽，菌体蛋白酶的活跃，培养液中氨基氮增加，致使pH又上升。1.1发酵过程中pH值的变化一般规律一、发酵过程中的pH变化及其原因1、基质代谢糖代谢特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一氮代谢当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。生理酸碱性物质被微生物利用后会导致环境pH下降（上升）的物质称为生理酸性（碱性）物质。1.2引起发酵过程pH变化的原因2、产物形成某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。3、菌体自溶发酵后期，pH上升，可做为终止发酵的指示。例：pH对林可霉素发酵的影响林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中间产物，发酵液pH下降，待有机酸被生产菌利用，pH上升。若不及时补糖、(NH4)2SO4或酸，发酵液pH可迅速升到8.0以上，阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素增长缓慢，甚至停止。对照罐发酵66小时pH达7.93，以后维持在8.0以上至115小时，菌丝浓度降低，NH2-N升高，发酵不再继续。发酵15小时左右，pH值可以从消后的6.5左右下降到5.3，调节这一段的pH值至7.0左右，以后自控pH，可提高发酵单位。例：培养基初始pH值对漆酶分泌的影响pH在4～7范围内产酶最高二、pH对发酵的影响1）影响酶活性继而影响微生物的生长繁殖。石油吃蜡酵母（解脂假丝酵母和热带假丝酵母）在pH3.5-5.0范围内生长良好且不易染菌；高于5时，形态变小，发酵液变黑，发酵过程中容易被细菌污染；pH低于3时，生长受到严重的抑制，细胞极不齐整，且出现细胞自溶的情况。102）影响原生质体膜的电荷pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行如产黄青霉细胞壁的厚度会随pH的增加而减小。pH低于6时，菌丝长度变短，直径为2-3μm，pH大于7时，菌丝直径为2-8μm膨胀菌丝增多，pH下降后，菌丝又恢复到正常状态。3）pH影响代谢产物的形成的数量和方向pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。如黑曲霉:在pH2-3时发酵产生柠檬酸，在pH近中性时，则产生草酸。谷氨酸发酵:在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺4）影响产物的稳定性如噻纳霉素的发酵中，pH值在6.7-7.5之间时，抗生素的产量相近，产品稳定性未受影响，半衰期也无变化，但当pH大于7.5时，抗生素半衰期缩短，稳定性下降，发酵产量也减少。5）pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响生长合成pH对菌体生长影响比产物合成影响小例青霉素：菌体生长最适pH3.5~6.0,产物合成最适pH7.2~7.4四环素：菌体生长最适pH6.0~6.8，产物合成最适pH5.8~6.0XpH四环素各种微生物适应的pH范围不同：细菌6.5-7.5;霉菌4.0-5.8;酶母菌3.8-6.0;放线菌6.5-8.0.微生物生长阶段和产物合成阶段的最适pH值往往也不一样。这与菌种的特性有关，也取决于产物的化学性质。三、最适pH的选择选择最适发酵PH的准则：获得最大比生产速率和合适的菌体量，以获得最高产量。最适pH值是根据实验结果来确定的。配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况pH对产海藻酸裂解酶的影响在各种类型的发酵过程中，实验所得的最适pH值、菌体的比生长速率(μ)和产物比生成速率(Qp)等3个参数的相互关系有四种情况：①μ和Qp的最适pH值都在一个相似的较宽的适宜范围内(a)，这种发酵过程易于控制；②Qp(或μ)的最适pH值范围窄，而μ(或Qp)的范围较宽(b)；③μ和Qp对pH值都很敏感，它们的最适pH值又是相同的(c)，第二、第三种情况的发酵pH值应严格控制；④μ和Qp有各自的最适pH值(d)，应分别严格控制各自的最适pH值，才能优化发酵过程。四、PH的调控策略1、配制合适的培养基，调节培养基初始PH至合适范围并使其有很好的缓冲能力。2、培养过程中加入非营养基质的酸碱调节剂，如CaCO3等防治PH过度下降。3、培养过程中加入基质性酸碱调节剂，如氨水等。4、加生理酸性或碱性盐基质，通过代谢调节PH。5、将PH控制与代谢调节结合起来，通过补料来控制PH。应急措施：改变搅拌转速或通气量，以改变溶解氧浓度，控制有机酸的积累量及其代谢速度；改变温度，以控制微生物代谢速度；改变罐压及通气量，降低CO2的溶解量；改变加油或加糖量等，调节有机酸的积累量；pH控制是一项非常细致的工作，不仅考虑最佳pH值，而且要根据生长阶段考察对pH的要求。在pH控制中还要采用合适的调节方法。总结小结发酵过程pH会发生变化变化原因基质代谢产物形成菌体自溶对发酵的影响pHpH影响酶的活性pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离pH影响代谢方向pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响pH的控制方式基础培养基调节pH在基础料中加入维持pH的物质通过补料调节pH当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH发酵的不同阶段采取不同的pH值选择合适的pH调节剂思考题7.12发酵过程中pH会不会发生变化为什么？7.13pH对发酵的影响表现在哪些方面？7.14为了确定发酵的最佳pH,我们该如何实验？7.15发酵过程的pH控制可以采取哪些措施？泡沫对发酵的影响及控制泡沫由于培养基中有蛋白类表面活性剂存在，在通气条件下，培养液中就出现了泡沫。泡沫是气体被分散在少量液体中的胶体体系，气液之间被一层液膜隔开，彼此不相连通。两种类型：机械性泡沫和流态泡沫基质中的有机氮源(黄豆饼粉等)的种类与浓度是影响起泡的主要原因本节内容：泡沫对发酵的影响发酵过程中泡沫的变化泡沫的控制一、泡沫的形成及其对发酵的影响在大多数微生物发酵过程中，通气、搅拌以及代谢气体的逸出，再加上培养基中糖、蛋白质、代谢物等表面活性剂的存在，培养液中就形成了泡沫。泡沫的多少与搅拌、通风、培养基性质有关。蛋白质原料如蛋白胨、玉米浆、黄豆粉、酵母粉等是主要的发泡剂。糊精含量多也引起泡沫的形成。当发酵感染杂菌和噬菌体时，泡沫异常多。少量泡沫的作用：一定数量的泡沫是正常现象，可以增加气液接触面积，导致氧传递速率增加；大量的泡沫引起许多负作用：发酵罐的装料系数减少、氧传递系统减小；增加了菌群的非均一性；造成大量逃液，增加染菌机会；严重时通气搅拌无法进行，菌体呼吸受到阻碍，导致代谢异常或菌体自溶；消泡剂的添加将给提取工序带来困难。二、泡沫的变化通气和搅拌：随通气和搅拌增加而增加，搅拌比通气影响大；培养基原料性质：蛋白胨、玉米浆、花生饼粉、黄豆饼粉、酵母粉等蛋白质原料是主要发泡物质；培养基灭菌方法：温度过高，形成蛋白黑色素，泡沫增多；细胞代谢活动：初期，高粘度、低张力，泡多；中期，粘度降、张力升，泡少；后期，自溶，泡上升。发酵过程泡沫的变化通气与搅拌的强度培养基的配比及原材料组成培养基的破坏程度接种量的大小培养液本身性质的变化培养基灭菌的方法和操作染菌三、影响泡沫稳定的因素不同搅拌速度和通气量对泡沫影响不同浓度蛋白质原科的起泡作用灭菌时间对泡沫稳定性的影响四、泡沫的消除①调整培养基中的成分（如少加或缓加易起泡的原料）或改变某些物理化学参数（如pH值、温度、通气和搅拌）或者改变发酵工艺（如采用分次投料）来控制，以减少泡沫形成的机会。②采用菌种选育的方法，筛选不产生流态泡沫的菌种，来消除起泡的内在因素。③采用机械消泡或消泡剂来消除已形成的泡沫。1.机械消泡物理消泡方法，利用机械强烈振动或压力变化而使泡沫破裂。优点：节省原料，减少染菌机会。缺点：消泡效果不理想，仅可作为消泡的辅助方法。罐内消泡——靠罐内消泡桨转动打碎泡沫。罐外消泡——将泡沫引出罐外，通过喷嘴的加速作用或离心力来消除泡沫2.消泡剂消泡A.消泡剂的作用：①降低泡沫液膜的机械强度；②降低液膜的表面黏度；③兼有两者的作用，达到破裂泡沫的目的。B.作为生物工业理想的消泡剂，应具备下列条件①应该在气－液界面上具有足够大的铺展系数，才能迅速发挥消泡作用，这就要求消泡剂有一定的亲水性；②应该在低浓度时具有消泡活性；③应该具有持久的消泡或抑泡性能，以防止形成新的泡沫；④应该对微生物、人类和动物无毒性；⑤应该对产物的提取不产生影响；⑥不会在使用、运输中引起任何危害；⑦来源方便，成本低；⑧应该对氧传递不产生影响；⑨能耐高温灭菌。C.常用的消泡剂有4大类：①天然油脂类②脂肪酸和酯类③聚醚类④硅酮类以天然油脂类和聚醚类在生物发酵中最为常用。♣豆油、玉米油、棉籽油、菜籽油和猪油等。♣油不仅用作消泡剂，还可作为碳源和发酵控制的手段。♣在发酵中，要控制油的质量、新鲜程度，并要进行发酵试验检验。♣聚醚类消泡剂品种很多，它们是氧化丙稀或氧化丙稀和环氧乙烷与甘油聚合而成的聚合物。♣聚氧丙稀甘油（GP型）——氧化丙稀和甘油聚合；亲水性差，在发泡介质中的溶解度小，所以用于稀薄发酵液中要比用于粘稠发酵液中的效果好；抑泡性能比消泡性能好，适宜用于基础培养基中，以抑制泡沫的产生。♣聚氧乙烯氧丙稀甘油（GPE型，泡敌）——氧化丙稀、环氧乙烷与甘油聚合；亲水性好，在发泡介质中易铺展，消泡能力强，作用快，溶解度大，消泡活性维持时间短，用于粘稠发酵液的效果比用于稀薄的好。D.应用消泡剂时的增效方法：①加载体增效，即用惰性载体（如矿物油、植物油等）使消泡剂溶解分散，达到增效的目的；②消泡剂并用增效，取各种消泡剂的优点进行互补，达到增效；③乳化消泡剂增效，用乳化剂（或分散剂）将消泡剂制成乳剂，以提高分散能力，增强消泡效力，一般只适用于亲水性差的消泡剂。GP和GPE1:1混合使用于土霉素发酵，结果比单独使用GP的效力提高2倍。用吐温-80制成的乳剂，用于庆大霉素发酵，效力提高1～2倍。在生产过程中，消泡的效果除了与消泡剂的种类、性质、分子量大小、消泡剂亲油亲水基团等密切相关外，还与消泡剂使用时加入方法、使用浓度、温度等有很大关系，应结合生产实际加以注意和解决。泡沫的检测和控制最简单的检测是定时在发酵罐视孔上观察泡沫产生情况，发现泡沫持续上升时，开启消泡剂贮罐的阀门，流加少量消泡剂，使泡沫消失即可。也可在罐内顶部装液位仪与控制仪表连结，用以控制消泡贮率阀门的开启。当泡沫上升接触探头顶端时产生的信号，通过控制装置，指令打开泵开关或阀门，自动加入消泡剂，泡沫消失，信号也随之消失，阀门关闭。高密度发酵及过程控制1.高密度发酵2.高密度发酵策略3.高密度发酵技术4.高密度发酵存在的问题1.高密度发酵代谢产物的合成是靠菌体作为生产者来完成的。高细胞密度发酵就是为了适应这一要求而得到广泛的重视。高密度发酵：在发酵过程中保持较高的细胞密度，同时细胞或菌体的生产能力保持在较佳的状态。高细胞密度发酵成功的实例菌种特征基础培养基发酵罐类型培养方法细胞干重（g/L）培养时间（h）产率(g/L)/d大肠杆菌需氧、葡萄糖过量、形成乙醇葡萄糖矿物盐或甘油矿物盐搅拌罐葡萄糖（甘油）非限制指数补料140～15030～4090～100枯草杆菌嗜温菌含葡萄糖的完全培养基搅拌