从口腔脱落细胞中提取人类基因组DNA

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从口腔脱落细胞中提取人类基因组DNA一.实验目的1、了解从细胞中提取DNA的基本原理2、学习从口腔脱落细胞中提取高分子量DNA的基本操作步骤和会影响提取效果的注意事项。二.实验原理1.用蛋白酶K(使膜上蛋白变性分解)和去污剂SDS(破坏细胞膜的脂质结构)共同消化细胞。2.然后酚、氯仿等有机溶剂进行抽提,进行DNA的纯化,去掉蛋白质、RNA、多糖等生物大分子。3.最后用无水乙醇沉淀DNA,干燥后用TE溶解,在4℃下可保存一年。三.实验步骤1、先用清水漱口。然后用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部,嘬咀,用分泌出的唾液反复漱口;将唾液吐到杯中。用1ml生理盐水洗涤,后将1.5ml液体转入1个干净的EP管中,2000rpm离心5分钟,倒掉上清。2、重复用1.0ml生理盐水洗涤沉淀1次,离心,去上清。3、沉淀中加500μl1x细胞裂解液(STE),打散细胞团、混匀,再加15μl20mg/ml蛋白酶K,充分混匀。55℃水浴30min。4、加500μl饱和酚,轻摇混匀,室温12000rpm离心10min。5、上清(注意不要吸到中间层白色絮状物质以及下层有机相)移至另一加入装有500μl氯仿的EP管,轻摇混匀,室温12000rpm离心10min。6、吸取400μl上清(注意不要吸到中间层白色絮状物质以及下层有机相)至已装有900μl预冷无水乙醇的离心管,混合均匀,可见白色絮状沉淀,10000rpm离心5min,DNA沉淀在管底。7、去上清,加入70%乙醇1ml清洗沉淀,10000rpm离心5min,去上清(尽量用小枪头将液体去干净,但注意不要将沉淀也吸走),室温干燥5min,再用50μlTEbuffer溶解沉淀,4℃储藏备用。四.实验结果五.结果分析编号:100如图所示,100号几乎没有提取出DNA,只有很弱的一条带,如果量再多一些的话,应该也看得到会有几条带。经过分析后认为主要以下几点原因:【1】.唾液稀释过度,导致取到的细胞很少。【2】.在破碎细胞的时候进行的不彻底,没有混匀,导致DNA抽提不完全。【3】.加入活性去污剂到加热30min的间隔有些长导致部分DNA被DNA水解酶降解。【4】.加入饱和酚的时候没有摇匀,蛋白质的去除不彻底,部分DNA与蛋白质结合,在分离DNA去除蛋白质的时候损失了不少DNA。此外,不同的条带代表提取出的DNA的大小不同,在实验过程中,可能由于剧烈震荡,或DNA水解酶的缘故使得DNA链被打断。因此出现了不同的几个条带。六.注意事项1.取唾液时既不能过分稀释,也不能太粘稠,发现细胞不足时要及时补充。2.裂解细胞的时候,要充分混匀活性去污剂,但震荡也不能太剧烈。最好及时放入水域锅中加热。3.加苯酚后要充分混匀,之后离心,尽可能多的将上清吸出,但注意不要取到中间的蛋白质。4.在最后用70%的乙醇清洗DNA后要尽可能多的把上清吸走。5.提取到的DNA要用TEbuffer保存。

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