测序技术

第二章基因组研究技术制备技术检测技术文库构建序列测定重组DNA技术基因组测序•一、测序技术•二、基因组测序策略•三、基因组图谱构建人类基因组计划（HumanGenomeProject－HGP）于1990年正式启动，其主要目标有：识别人类DNA中所有基因（超过10万个）；测定组成人类DNA的30亿碱基对的序列；将这些信息储存到数据库中；开发出有关数据分析工具；致力于解决该计划可能引发的伦理、法律和社会问题。人类基因组计划是当代生命科学一项伟大的科学工程，它奠定了21世纪生命科学发展和现代医药生物技术产业化的基础，具有科学上的巨大意义和商业上的巨大价值。杂交测序法质谱法单分子测序法原子探针显微镜测序法流式细胞仪测序法大规模平行实测法经典方法新技术方法双脱氧链终止法(Sanger&Coulson1977)化学降解法(Maxam和Gilbert,1977)Maxam-GilbertDNA化学降解法(Maxam和Gilbert，1977)Sanger双脱氧链终止法（Sanger和Coulson，1977）DNA杂交测序法第二代测序技术第三代测序技术测序技术应用经典测序技术Maxam-GilbertDNA化学降解法(Maxam和Gilbert，1977)Sanger双脱氧链终止法（Sanger和Coulson，1977）1970年发明了第一种DNA测序方法Maxam-Gilbert化学分析法1977年哈佛大学A.M.Maxam和W.Gilbert发明原理：化学试剂处理末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割产生一组具有不同长度的DNA链混合物经凝胶电泳分离和放射自显影，读出待测DNA片段的核苷酸序列Sanger双脱氧链终止法Sanger于1977年在加减法测序的基础上创建了双脱氧链末端合成终止法（chainterminationmethod），简称Sanger法、双脱氧法或酶法。Sanger双脱氧链终止法一、基本原理二、测序反应体系的组成三、双脱氧链终止法的特点四、毛细管电泳五、DNA自动化测序一、基本原理单链DNA模板、DNA合成引物、DNA聚合酶以单链DNA为模板，合成出准确的DNA互补链能够利用2’，3’-双脱氧核苷三磷酸作底物，参入到寡核苷酸链的3’-末端，DNA链延长终止双脱氧链终止法的测序基础是以双脱氧核苷三磷酸为测序反应的链终止剂。POHdNTPddNTPPOHOHPPPPOH双脱氧链末端终止法测序原理示意图二、测序反应体系的组成（一）待测模板1．单链模板DNASanger法经典测序反应--将待测DNA片段克隆于M13mp载体中，得到单链的DNA模板，再按Sanger法进行测序。2．双链模板DNA将待测的DNA片段克隆到质粒载体上，得到含待测DNA克隆片段的双链质粒，经碱变性处理，与寡核苷酸引物序列退火，按Sanger法进行测序；PCR产物Sanger双脱氧-M13体系M13--噬菌体载体，可得到单链DNA序列Sanger双脱氧-pUC体系pUC--质粒载体，利用双链质粒DNA模板的双脱氧DNA序列分析法（二）引物“通用”引物：在DNA聚合酶催化的测序反应中需要测序引物。不论是单链DNA模板，还是双链DNA模板，都可通过使用克隆位点两侧的载体序列互补的“通用”引物；通用引物长度：一般为15～30个核苷酸。（三）DNA聚合酶1．大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）：Sanger法最早使用的酶，具有5’→3’聚合酶和3’→5’外切酶活性，催化链延伸反应的能力较差，用它进行测序常产生较高的本底和假带；2．测序酶（sequenase）：经过修饰的T7噬菌体DNA聚合酶，消除了3’→5’外切酶活性。酶活非常稳定，很高的链延伸能力和极快的聚合反应速度，测定较长DNA的首选酶；3．TaqDNA聚合酶：PCR反应关键酶，在95℃的高温下保持稳定，可在高温下进行反应，该酶用于测序具有很好的链延伸性能，能克服富含GC序列的模板形成自身二级结构对测序的影响。（四）放射性核素标记的dNTPα-32P-dNTP或α-35S-dNTP。目前通常采用α-35S-dNTP。（五）测序产物的凝胶电泳及识读能否将测序反应中产生的各种不同长度的DNA片段进行有效分离是序列分析成败的关键。三、Sanger双脱氧链终止法的特点1.快速简便，一次反应可测500个以上的碱基序列；2.荧光染料代替放射性核素标记，使该法便于实现自动化分析，能够满足绝大多数DNA样品序列分析的需要。四、毛细管电泳CE,Capillaryelectrophoresis以高压直流电场为驱动力，在毛细管内使带电粒子按淌度或分配系数进行分离的一种电泳技术。优点：分辨率高、重现性好、灵敏度高、快速、自动化。毛细管凝胶电泳非凝胶基质毛细管电泳阵列毛细管电泳毛细管凝胶电泳CGE，Capillarygelelectrophoresis将平板电泳的凝胶移到毛细管中做支持物进行电泳，由于电场强度比板凝胶电泳大大提高，使分离时间缩短约25倍；聚丙烯酰胺凝胶作筛分介质，黏度大、抗对流，能减少溶质的扩散，有极好的分离效果，除用于DNA序列分析外，还可用于DNA片段的分离和PCR产物的分析。问题：制备凝胶柱费力；凝胶形成和电泳期间产生的气泡影响分离；使用过程中焦耳热对分离介质的降解使毛细管的寿命缩短等。非凝胶基质毛细管电泳为避免CGE存在的问题，非凝胶基质毛细管电泳用于DNA分析的研究越来越多；非凝胶基质：线性聚丙烯酰胺和纤维素衍生物非凝胶基质在DNA测序中可以更换，使毛细管的寿命延迟，在优化条件下可获得高效及高速的分离效果。阵列毛细管电泳CAE，Capillaryarrayelectrophoresis将毛细管电泳与板凝胶电泳的优势相结合，采用毛细管凝胶电泳的装置，将多支毛细管并列进行分离与检测，以板凝胶电泳的优势弥补了毛细管凝胶电泳的不足，可一次检测多个样品；阵列毛细管电泳散热效率高，适于高电场强度电泳，是一种高速、高通量的测序法；使用非凝胶基质，毛细管壁可以抑制横向扩散，具有易于实现自动化的优点。激光测序法终止标记系统用4种不同的荧光染料标记不同的ddNTP；测序反应在同一反应管内进行，无需分成4管；反应产物按终止位置的碱基不同其3’末端带有不同的荧光基团，被激发后产生不同的荧光；反应产物加样于凝胶的同一加样孔，电泳分离后，经过DNA测序仪分析系统识别，将检测信号不断传送到计算机，通过软件分析，自动读出待测DNA的全部核苷酸序列。五、DNA自动化测序激光测序法终止标记系统测序原理示意图测序仪原理BigDyeTerminators--美国应用生物系统公司专利，四色荧光分别标记的起链终止剂作用的四种ddNTPs；一个反应管中完成循环测序反应，通过一个电泳道电泳即可完成测序任务；传统双脱氧链终止法：四个反应管循环测序反应，四个泳道电泳检测。1.荧光标记2.循环测序3.电泳与结果分析染料受测序仪氩离子激光激发而发射出特定光谱的四种不同颜色的荧光；测序仪的专用激光扫描镜头实时扫描不同大小的DNA片段在相应时间通过垂直电泳胶读数区时发射的荧光，将不同大小DNA片段发射的荧光实时地传递给计算机测序数据实时收集软件；电泳结果转换成胶图文件及原始数据信号；当电泳完毕后，DNA序列分析软件通过分析胶图文件及原始数据信号，得到最终的测序结果；1,000bp的DNA片段，准确率高达99.999%，费用约0.5美元/1,000个碱基。377型遗传分析仪310型遗传分析仪3100遗传分析仪3730遗传分析仪DNA杂交测序（sequencebyhybridization）SBH原理：如果一段短的DNA探针能够与较长的靶DNA片段杂交，并形成完全的双链分子，可据此推断靶DNA序列相对应的互补序列步骤：将待测的靶DNA分子与一组已知核苷酸序列的寡核苷酸探针进行杂交比较分析与待测DNA杂交的探针之间的碱基重叠关系，据此推算靶DNA的核苷酸序列SBH的应用：1.检测靶DNA的单碱基突变；2.用于不同片段之间的序列比较分析；（同源性序列检测）3.用表达序列标签（EST）的矩阵芯片，检测不同类型细胞中或不同生长发育状态下的细胞中特定基因的表达状况；4.检测传统的测序技术所得DNA片段的核苷酸序列数据。第二代测序技术新一代DNA测序仪循环芯片测序法cyclic-arraysequencing454基因组测序仪--美国RocheAppliedScience公司Illumina测序仪--美国Illumina公司和英国Solexatechnology公司合作开发SOLiD测序仪--美国AppliedBiosystems公司Polonator测序仪--Dover/Harvard公司HeliScope单分子测序仪--美国Helicos公司合成测序法的两种策略•循环可切除终止测序法（cyclicreversibleterminationtechnology）：依次逐个添加荧光标记的碱基，继而检测荧光信号，切除荧光基团，如此往复；•焦磷酸测序法：通过检测碱基掺入时发出的光来进行测序，无需电泳分析，454基因组测序仪454测序仪的先行者地位•Leamon、Rothberg等人撰写的一篇介绍该技术的论文被引用了570多次•100多篇经过同行审议的关于人类遗传学、代谢组学、生态学、进化学以及古生物学的论文（peer-reviewedpublications）都是使用454测序仪开展的研究一个4Mb基因组和3个6Mb基因组测序•传统的Sanger测序法：需要好几个月的时间，•454测序仪，一位实验人员，包括样品制备等步骤在内所用的时间仅需要一周•使用454测序仪还避免了传统测序方法中细菌克隆阶段可能出现的错误，获得了高质量的测序结果•发现了导致结核分枝杆菌对R207910产生抗药性的两个点突变位点，此研究成果使得人类最近的40年内第一次找到了特异性治疗结核病的药物•2007年6月，JamesWatson的基因组序列登录到了GenBank数据库当中，这是第一次使用非Sanger测序法获得了人类个体基因组序列，且第一次将个人基因组序列公之于众•整个测序在两个月之内完成，花费不到100万美元，仅占耗时10年之久的人类基因组计划使用经费的千分之一，Venter基因组计划费用的百分之一•454测序仪最初的技术参数（每次可以获得两千万碱基序列，测序长度100bp，准确率96%）•JamesWatson测序时的技术参数（一亿碱基序列，250bp，99%）•个体基因组测序的费用由100,000美元降低到10,000美元，继而降低到1,000美元甚至更低•采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔实现测序•核酸分子中每一个核苷酸通过孔道时出现一种特定形式的电流改变，通过分析电流改变确定核酸序列第三代测序技术—新型纳米孔测序技术•目标：10年内完成1,000美元检测个人基因组•美国国家人类基因组研究所（NHGRI），已经给纳米孔测序研究提供了多次经费支持基因组项目(全程测序)人，鼠，酵母，病原微生物，水稻，玉米等cDNA测序(EST或全长测序)比较测序或杂合子测序单核苷酸多态性（SNP）的发现与验证突变检测BRCA,MSH2/MLH1,p53依据于测序的分型试剂盒应用于器官移植等的HLA配型试剂盒应用于法医的线粒体测序指导临床治疗的HIV基因型检测试剂盒针对16SrRNA的细菌鉴定试剂盒针对D2rDNA的真菌鉴定试剂盒DNA测序技术的应用二、基因组测序策略DNA测序策略基因组测序策略重叠群法直接鸟枪法DNA测序策略根据待测DNA分子性质、测序方法、测序目的、测序要求，制定测序总策略。一、已知序列的确证性测序策略二、未知序列的从头测序策略一、已知序列的确证性测序策略确证性测序confirmatorysequencing：对已知的核酸序列进行鉴定和证实；突变检测：临床