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1ABTS自由基清除/PTIO自由基清除实验：实验流程图2018.4（含ABTS自由基配制方法）图1ABTS自由基清除实验和PTIO自由基清除实验的流程图【说明】体内（细胞内）的自由基，可以分为两类：活性氧（ROS，Reactiveoxygenspecies）和活性氮（RNS，Reactivenitrogenspecies）。ROS主要有羟基自由基·OH，过氧自由基(·O2-)，脂质过氧自由基(LOO·)等；RNS主要有一氧化氮（·NO）等。这些ROS和RNS如果过量堆积，会引起氧化应激，发生各种病变，加速机体衰老。许多药用植物的提取物，能清除ROS和RNS。这种清除作用可以缓解氧化应激，故称为抗氧化。上述提到的RNS和ROS其实，都是不稳定的（如·OH，·O2-，LOO·，·NO），很难直接用于抗氧化评价实验。ABTS自由基清除法是最常见的用于评价药用植物或纯化合物的抗氧化活性的一种方法，因为，ABTS+·自由基较稳定，稳定的ABTS+·自由基的甲醇或乙醇溶液呈深紫红色，并在734nm范围有最大吸收峰。当向ABTS自由基溶液中加入自由基清除剂(抗氧化剂)时，成单被配对，ABTS自由基溶液褪色，734nm波长处的吸收值降低，可以用分光光度计测定。ABTS自由基之所以稳定，由于N原子上那个成单电子，可以与苯环形成2p-π共轭。ABTS+·自由基(亦称ABTS+·自由基离子)，并不是一个现成的试剂。只能通过粉末状ABTS二铵盐，将其氧化，才能得到ABTS+·自由基。其反应可表示如下：NSO3S-NH4+C2H5NNNSSO3-NH4+C2H5ABTS二铵盐(MW.548.7)2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonicaciddiammoniumsalt)K2S2O8NSO3S-NH4+C2H5NNNSSO3-NH4+C2H5-eABTS自由基图2ABTS二铵盐被氧化成ABTS+·自由基清除的反应式从结构式中可以看也，其成单电子位于N原子上，所以，是RNS而不是ROS。所以，严格讲，ABTS法只能用于评价RNS清除水平而不是ROS清除水平。如果要评价ROS清除水平，必须用相对稳定的氧自由基。PTIO自由基，即是一种相对稳定的氧自由基。NNH3CH3CH3CH3COOπ-πconjugation图3PTIO自由基结构式由结构式可知，PTIO自由基的成单电子是位于氧原子上的，而且，旁边有大的π-π共轭体系，所以，其结构相对稳定。其甲醇溶液呈深紫色，并在586nm范围有最大吸收峰；其水溶液呈深紫色，并在557nm范围有最大吸收峰。所以，既可以用水作溶剂，也可以用甲醇作溶剂。具体，则视样品的溶解性而定。如果能将ABTS自由基清除和PTIO自由基清除相结合，则既能反映RNS清除水平，又能反映ROS清除水平，所以可全面地评价药用植物或纯化合物的抗氧化活性。【文献】XicanLi.2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl3-oxide(PTIO•)Radical-scavenging:ANewandSimpleAntioxidant.JournalofAgricultural&FoodChemistry.2017,65,6288−6297.