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Biacore结合实验的设计方法2/GETitleorjobnumber/2009-8-25内容一、实验的结合方式二、Biacore分析的基本步骤•芯片表面预处理•进样•再生•数据分析实验的结合方式4/GETitleorjobnumber/2009-8-25直接结合样品（Sample）分析物（Analyte）配体（Ligand）直接检测5/GETitleorjobnumber/2009-8-25直接结合使反应信号加强的直接结合--三明治法(sandwichapproach)配体分析物信号加强分子260002700028000290003000031000050100150200250300350400450时间sResponseRU6/GETitleorjobnumber/2009-8-25间接结合抑制检测(溶液内竞争)检测游离的目标分子+Ç分析物被检测的目标分子7/GETitleorjobnumber/2009-8-25间接结合芯片表面竞争检测分析物配体竞争分析物+Ç检测混合物信号Biacore分析的基本步骤9/GETitleorjobnumber/2009-8-25Biacore分析的基本步骤芯片表面预处理进样再生10/GETitleorjobnumber/2009-8-25芯片表面预处理偶联什么是偶联?•利用共价结合或捕获的方式将目标样品偶联在芯片表面须考虑的因素•偶联什么蛋白?•应该选择哪种传感芯片?•怎样偶联?•哪种偶联水平是恰当的?芯片表面预处理11/GETitleorjobnumber/2009-8-25偶联什么蛋白?注意事项•蛋白分子量判断偶联量是否满足实验•PI(等电点)判断是否可以进行氨基偶联，PI要求不小于4左右。•蛋白质标签判断是否可以采用捕获标签的方式进行偶联•纯度高于90%•偶联蛋白的活性保持在哪种缓冲溶液下有活性，蛋白与蛋白的相互作用推荐使用HBS-EPBuffer，蛋白与小分子推荐使用PBSBuffer。•可利用的蛋白量以30-50KD蛋白为例，准备蛋白浓度10-50ug/ml，1ml左右，随着蛋白性质的不同和分子量的变化可以调整。•化合价(结合位点的数目)芯片表面预处理12/GETitleorjobnumber/2009-8-25应该选择哪种传感芯片?Biacore为各种仪器提供9种传感芯片满足广泛的实验需求芯片表面预处理13/GETitleorjobnumber/2009-8-25传感芯片CM5•羧基化的葡聚糖表面•最常用的传感芯片•卓越的化学稳定性实验的首选芯片表面预处理14/GETitleorjobnumber/2009-8-25传感芯片CM4和CM3传感芯片CM4•羧基化的葡聚糖表面，羧基化程度低于CM5(所带的负电荷较少)•减少了对带强正电荷蛋白的非特异性结合，例如在细胞的水解样品和匀浆中•比较容易得到较低的Rmax，便于进行动力学研究传感芯片CM3•羧基化的葡聚糖表面•葡聚糖链长度较CM5短,但羧基化程度相同•适用于细胞、病毒和多组分的混合物•便于得到较低的偶联水平芯片表面预处理15/GETitleorjobnumber/2009-8-25传感芯片C1不含葡聚糖的羧基表面适用于小型分子颗粒如细胞、病毒以及一些不需葡聚糖的研究的应用芯片表面预处理16/GETitleorjobnumber/2009-8-25传感芯片SA•在羧基化的葡聚糖表面覆盖了一层链霉生物素•（streptavidin）•非常适合用于捕获生物素标记的DNA大片段，进行核酸之间的相互作用研究•可捕获生物素标记的配体，如糖类、肽段，蛋白质，DNA等芯片表面预处理17/GETitleorjobnumber/2009-8-25传感芯片NTA•在羧基化的葡聚糖表面覆盖了一层氨三乙酸（NTA）•通过金属螯合作用捕获带有末端组氨酸修饰（His-tagged）的配体蛋白分子•空间定向结合能很好地保持生物分子的空间结构•只需普通的再生条件芯片表面预处理18/GETitleorjobnumber/2009-8-25传感芯片HPA•疏水表面•适用于单层脂质分子和膜相关蛋白的相互作用分析•为细胞膜相关蛋白的相互作用分析提供了增溶技术•研究细胞膜受体在膜环境内与配体的相互作用芯片表面预处理19/GETitleorjobnumber/2009-8-25传感芯片L1•在羧基化的葡聚糖表面覆盖了一层亲脂物质•适用于在保持磷脂双分子层的结构的同时，快速和高重复性地捕获脂质体分子•不需对锚定的分子进行合并芯片表面预处理20/GETitleorjobnumber/2009-8-25传感芯片–总结CM5:最常用的传感芯片CM4:为获取更低的Rmax，并减少类似于在天然样品中发生的非特异性结合CM3:为获取更低的配体偶联水平，应用于细胞、病毒和其他大分子量的待分析物C1:适用于小型分子颗粒如细胞、病毒以及一些不需葡聚糖的研究的应用SA:捕获生物素标记的配体NTA:捕获His-tag修饰的配体HPA:构建细胞膜的研究模型L1:直接捕获脂质体分子并维持其活性AU：裸金的传感芯片，表面只有金膜，支持用户在仪器外使用化学方法进行偶联芯片表面预处理21/GETitleorjobnumber/2009-8-25怎样偶联?直接偶联•共价化学键•高偶联量•常为不均一的表面AmineLigandThiolSurfaceThiolStreptavidin-BiotinAnti-GST-GSTNTA-6HisAnti-His–6HisAnti-FLAG-FLAGRAM-Mabanalyteligandanalyteligandcapturingmolecule捕获•位点特异性•低偶联量•选择的配体从天然样品中被捕获芯片表面预处理22/GETitleorjobnumber/2009-8-25氨基偶联（AmineCoupling）•活化=EDC/NHS注射Æ表面酯化•配体偶联=和配体上的氨基发生反应•封闭=用乙醇胺封闭芯片上多余的有活性的羧基活化配体偶连封闭使用CM5芯片进行氨基偶联是实验的首选芯片表面预处理23/GETitleorjobnumber/2009-8-25氨基偶联的预结合（Pre-concentration）配体通过静电效应，配体带正电、葡聚糖带负电，聚集在芯片表面3.5pHpIpHpIligandisolectricpointpIpH3.5ligandisolectricpointpIligandisolectricpointpIsurfacepK3.5asurfacepK3.5asurfacepK3.5a•有效的预结合pH范围处于芯片表面的pka和配体的蛋白等电点(pI)之间.pH=pI蛋白质等电点：该pH下目标蛋白不带电荷pHpI蛋白质等电点:目标蛋白带正电荷pHpI蛋白质等电点:目标蛋白带负电荷芯片表面预处理24/GETitleorjobnumber/2009-8-25氨基偶联pH的选择(1)•做活化和封闭的偶联之前，必须根据实验的尝试找到最适的偶联pH•pH3.5时，芯片表面的葡聚糖带负电•偶连缓冲液的pH应该高于3.5,但低于配体蛋白的等电点•对许多蛋白来说,适合使用10mMNaAc缓冲液(pH4.5)•缓冲液中的离子强度必须较低芯片表面预处理25/GETitleorjobnumber/2009-8-25氨基偶联pH的选择(2)使用不同PH值的10mMNaAc缓冲液溶解配体，注射2分钟左右根据预结合得到的实验结果判断最合适的偶联PH值•相同时间内结合的越多，峰型越陡，并且没有饱和现象出现的为最适PH值•如果相邻PH的结合结果相差不多，选用靠近中性的PH值配体浓度：参考30-50KD蛋白为例，准备蛋白浓度10-50ug/ml此操作运行ApplicationWizard–SurfacePreparation–immobilizationPHScouting程序芯片表面预处理26/GETitleorjobnumber/2009-8-25如何选择偶联策略：由配体性质决定不稳定的配体捕获（e.g.GST、His标签）不纯的配体捕获（e.g.GST、Biotin、His标签）共价结合后发现活性丢失酸性配体再生困难尝试其他官能团（e.g.巯基）捕获或改变结合化学键（e.g.巯基偶连）捕获芯片表面预处理27/GETitleorjobnumber/2009-8-25哪种偶联水平是恰当的?•配体的偶联水平决定了配体和分析物分子的结合值的高低•Rmax描述了分析物结合配体时的最大蛋白结合量•不同应用所需的偶联水平和Rmax也不同当做结合实验时，希望得到结合大一些的信号，因此芯片表面偶联的水平要尽量高一些。当做亲和力实验时，为使实验准确，希望Rmax低一些，通常为100RU左右，因此芯片表面偶联的水平要低一些。mLmaxSRMWligandMWanalyteR××=RL=芯片表面的偶联水平Sm=化学计量比1：1理论的Rmax往往高于实际的Rmax芯片表面预处理28/GETitleorjobnumber/2009-8-25练习–计算RL如果希望Rmax是100RU，应该在芯片上偶联多少配体?AnalyteMW=25,000DaLigandMW=150,000DaSm=1Rmax=100RUmLmaxSRMWligandMWanalyteR××=芯片表面预处理29/GETitleorjobnumber/2009-8-25使用targetingwizard控制偶联水平直接设定需要偶联的目标RU值，仪器自动完成•使用预结合估计蛋白结合比率•冲洗•芯片表面的活化•以“脉冲”方式加入配体直至达到目标水平(第一次进样长度由预结合结果确定)•芯片表面多余位点的封闭此操作运行ApplicationWizard–SurfacePreparation–immobilization程序芯片表面预处理30/GETitleorjobnumber/2009-8-25Biacore分析的基本步骤芯片表面预处理进样再生31/GETitleorjobnumber/2009-8-25不同的“Inject”种类不同的进样种类提供了不同性质的实验结果:•QUICKINJECT:样品用量低，但有可能发生样品和缓冲液的混合污染，注射再生溶液时可以使用•INJECT:样品用量中等，混合污染的可能性小，大多数实验下使用•KINJECT:样品和缓冲液能得到最大程度的分离，但样品消耗量相对较大，进样32/GETitleorjobnumber/2009-8-25不同的“Inject”种类应用流体学（Thefluidics）除了必需进样体积的样品外，其他样品都被转入废液收集器QuickInject(必需的进样体积+10μl)必需进样体积+5μl+5μlAIR5μlAIR5μlBUFFERBUFFERInject(必需的进样体积+30μl)必需进样体积+5μl+5μl+10μl+10μlAIR5μlAIR5μlAIR5μlAIR5μlBUFFERBUFFERKinject(必需的进样体积+40μl)必需进样体积+5μl+5μl+5μl+5μl+10μl+10μlAIR5μlAIR5μlAIR5μlAIR5μlAIR5μlAIR5μlBUFFERBUFFER进样33/GETitleorjobnumber/2009-8-25结合与容积差（BulkEffects）容积差是因为仪器缓冲液和样品溶液折射率的不同而产生因此Biacore实验需要仪器缓冲液和样品缓冲液保持一致BulkBuffer1Binding+BulkBuffer1进样34/GETitleorjobnumber/2009-8-25对照表面（Referencesurfaces）•如果样品溶解缓冲液和仪器运行缓冲液成分不同，容积差可通过设置对照表面来消除•对照表面应该设置在结合反应表面的上游•当对进样过程进行分析时，对照表面的消减对检测结果非常重要进样35/GETitleorjobnumber/2009-8-25对照表面的设计空白表面•适用于大多数实验•检