DNA测序方法

DNA测序原理与方法DNA测序：是对DNA分子的一级结构的分析。其基本原理是DNA的复制反应体系中需要存在DNA聚合酶、DNA模板、寡核苷酸引物和dNTP，引物和模板退火形成双链后，DNA聚合酶在引物的引导下在模板链上沿3’→5’的方向移动，dNTP按照碱基配对原则，逐个连接在引物的3’-OH末端。双脱氧链终止法测序化学降解法测序自动化测序基因芯片测序双脱氧链终止法测序(thechainterminationmethod)基本原理：通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。用于终止反应的双脱氧核苷酸：将2’，3’–双脱氧核苷酸（ddNTP）参入到新合成的DNA链中，由于参入的ddNTP缺乏3’–羟基，因此不能与下一位核苷酸反应形成磷酸二酯键，DNA合成反应将中止。Maxam-Gilbert化学降解法测序基本原理：将一个DNA片段的5'端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而5'端被标记的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的DNA的碱基序列。硫酸二甲酯[dimethylsulphate，DMS，（CH3O）2SO2]是一种碱性化学试剂，可以使DNA链上的腺嘌呤A的N2和鸟嘌呤G的N７甲基化，但是鸟嘌呤G的N７甲基化速度比腺嘌呤A的N2甲基化速度要快4-10倍，并且在中性pH环境中，DMS主要作用于鸟嘌呤G，使之甲基化，导致糖苷键断裂。哌啶甲酸可以使DNA链上的嘌呤在酸的作用下发生糖苷水解，导致DNA链在脱嘌呤位点（G和A）发生断裂。肼，又称联氨NH2.NH2，在碱性环境中作用于胞嘧啶C和胸腺嘧啶T的C4和C6位置，导致糖苷键断裂。如果加入高浓度的盐（1.2MNaOH），肼则主要作用于胞嘧啶C，使之断裂。作为标记用的放射性同位素主要有γ-32Ｐ（[γ-32Ｐ]ATP，[γ-32Ｐ]GTP.[γ-32Ｐ]TTP，或[γ-32Ｐ]CTP）。Maxam-Gilber法所能测定的长度要比Sanger法短一些，它对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。Sanger法需要单链模板和特异寡核苷酸，并需获得大肠杆菌DNA聚合酶IKlenow片段的高质量酶制剂，而Maxam-Gilbert法只需简单化学试剂。随着M13噬菌体和噬菌粒载体的发展，也由于现成的合成引物唾手可得及测序反应日臻完善，双脱氧链终止法如今远比Maxam-Gilbert法应用得广泛。然而，化学降解较之链终止法具有一个明显的优点：所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成所产生的拷贝。因此，利用Maxam-Gilbert法可对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况。由于Sanger法既简便又快速，因此是现今的最佳选择方案。事实上，目前大多数测序策略都是为Sanger法而设计的。自动化测序基本原理：与链终止法测序原理相同,只是用不同的荧光色彩标记ddNTP,如ddATP标记红色荧光,ddTTP标记绿色荧光,ddCTP标记蓝色荧光,ddGTP标记黄色荧光,.由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基.芯片测序原理：杂交测序方法，即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法。在一块基片表面固定了已知序列的八核苷酸的探针，当溶液中带有荧光标记的核酸序列TATGCAATCTAG，与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探针位置，获得一组序列完全互补的探针序列。据此可重组出靶核酸的序列。1ATACGTTA2GTTAGATC3ACGTTAGA4CGTTAGAT5GTTAGATCDNA样品TATGCAATCTAG与基因芯片上65,000种可能的八聚体进行杂交从而形成特定的结合图形计算机分析杂交图象并由探针的重叠情况推导样品的核酸序列1ATACGTTA3TACGTTAG4ACGTTAGA2CGTTAGAT5GTTAGATC3TACGTTAG4ACGTTAGA2CGTTAGAT互补序列为：ATACGTTAGATC样品序列为：TATGCAATCTAG