DNA测序

第10章DNA测序技术生化与分子生物学学科2012.4分子生物学检验技术∙第十章目前应用的两种快速序列测定技术:F.Sanger等（1977年）提出的酶法-双脱氧链终止法A.Maxam和W.Gilbert（1977年）提出的化学降解法Sanger本人也出其突出的贡献而荣获诺贝尔奖。第一节双脱氧链末端终止法TheDideoxyChainTerminationMethod生物体内，在DNA聚合酶作用下，以单链DNA为模板合成互补的DNA链。根据碱基配对的原则，将脱氧核糖核苷(dNTP)底物加到引物的3′－OH末端，使引物延伸链的延长通过引物的3’-0H基，与脱氧核糖核苷酸底物的5’-磷酸基因，生成磷酸二酯键而实现，其合成方向由5’→3’。基本原理：Sanger发现在DNA聚合反应过程中，掺入一种双脱氧核糖核苷酸（ddNTP）底物时，它的5’-磷酸基因是正常的，能够加到正常核苷酸的3’-OH基末端，但其自身3’-OH基团由于脱氧而不存在，下1个核苷酸不能通过5’-磷酸与之形成磷酸二酯键，使DNA链的延伸被终止于这个双脱氧核糖核苷酸处。脱氧核苷酸及双脱氧核苷酸结构比较O碱基CPOHH12345O碱基CPOHH12345OH脱氧核苷酸的连接DNA测序O碱基CPOH12345O碱基CPOHH12345H2O脱氧核苷酸的连接O碱基CPHH12345O碱基CPOHH12345OH×双脱氧核苷酸…?反应体系：以待测序列的DNA为模板，加入引物和4种dNTP（其中一种为α-32P标记），将此反应物分为4等份，每份内再加入一定比例的一种ddNTP，如此形成A、T、C、G四个反应体系，最后在各反应体系中加入DNA聚合酶催化DNA片段合成。这样各反应体系中即可形成一种全部具有相同的5’-引物端和一种以ddNTP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段。四套反应体系1--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddATP2--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddCTP3--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddGTP4--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddTTPATTCAGCAGGACTA5’3’测序模板5’TA5’TAA5’TAAGTCGTCCTGACCC第一套反应第二套反应5’5’5’ACGTATGGTACCGCATModelDYCZ-20ADNASequenceAnalysisElectrophoresisTank第二节化学裂解法Maxam－GilbertDNA序列分析法Maxam-GilbertDNA化学降解法基本步骤(1)先将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P；(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰；(3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链；(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开；(5)根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列。G：用硫酸二甲酯对G的N7进行甲基化，其后断开C8－N9间的化学键，哌啶置换了被修饰的G与核糖结合。A＋G：甲酸使嘌呤环上的N原子质子化，从而消弱了腺嘌呤脱氧核糖核酸和鸟嘌呤脱氧核糖核酸中的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。C＋T：肼打开嘧啶环，然后被哌啶置换。C：在NaCl存在时，只有C可同肼发生反应，随后被修饰的C由哌啶置换。由于种种原因（如采用32P进行放射性标记、末端标记DNA的比活度、裂解位点的统计学分布、凝胶技术方面的局限性等等），Maxam-Gilber法所能测定的长度要比Sanger法短一些，它对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。化学降解较之链终止法具有一个明显的优点：所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成所产生的拷贝。因此，利用Maxam-Gilbert法可对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况。第三节DNA的序列分析的自动化全自动的测序仪器：MegaBaceMegaBACE4000毛细管测序仪Sanger法测序技术的发展手工测序仪器自动测序全自动化操作系统代替手工操作；荧光染料标记代替放射性同位素标记；PCR扩增代替基因文库；集束化的毛细管电泳代替PAGE电泳；高速自动化的序列分析系统代替人工识读。DNA测序的自动化是在Sanger的双脱氧链末端终止法的基础上由美国应用生物系统公司进一步发展起来的激光测序法，其基本原理与末端终止法一样，都是通过ddNTP竞争性的终止新合成的DNA链。自动化测序主要差别在于非放射性标记方式和反应产物分析系统。一、基于单一荧光染料标记的自动化测序系统用单一的Cy5荧光染料标记测序引物或dNTP进行测序。用Sanger法原理进行测序反应，分别生成四组终止于4种不同碱基、带有Cy5荧光素标记的DNA片段。A、T、G和C四组反应产物在不同的泳道上电泳，用激光激发荧光探测光信号，计算机分析，得出样品DNA的序列。单一荧光染料标记的自动化测序示意图DNA自动测序二、基于多种荧光染料标记的自动化测序系统早在1987年PerkinElmer(PE)AppliedBiosystems公司就推出DNA自动测序仪，其专利是分别采用4种荧光染料进行标记且在同一个泳道测序，具有极大的优越性。其原理是采用四种荧光染料标记终止物ddNTP或引物，经Sanger测序反应后，产物3′端(标记终止物ddNTP法)或5′端(标记引物法)带有不同荧光标记，一个样品的4个测序可以在一个泳道内电泳，从而降低了测序泳道间迁移率差异对精确性的影响。由于增加了一个电泳样品的数目，可一次测定96个或更多样品。4色荧光标记物ddGTPddATPddTTPddCTPSanger第一步：4色发应荧光检测探头电泳，看谁跑得快Sanger第二步：荧光检测跑的快慢定顺序，荧光颜色定碱基为什么这种测序方法一次只能测定一定长度的DNA片段？3730XL系列DNA分析仪第四节DNA序列测定的基本策略开始测序之前，必须根据待测序列区的长度、所要求的测序精确度以及现有的设施来制定测序总策略。只有一小部分的研究计划需要从头测定大段从未测定过的序列；未知序列的从头测序策略。而更多的情况是要通过测序对突变进行定位和鉴定，或证实所构建的重组DNA的方向与结构等。既已知序列的确证性测序策略。一、确证性测序confirmatorysequencing多数情况下，测序是对已知序列进行鉴定和证实。如：保守序列分析、点突变检测、阅读框的判定等。如何获得目的片段？PCR基因克隆确证性测序(例如对利用寡核苷酸介导的诱变而产生的突变体进行测序)往往只需要进行一套反应，取得双链DNA其中一条链上局部区域的核苷酸序列，通常只须对亚克隆于M13噬菌体或噬菌体载体上的一段合适的限制酶切片段进行测序，即可如愿以偿。二、从头测序denovosequencing确定一个未知序列的准确长度及核苷酸排列顺序。未知序列的DNA测序策略取决于其长度。Why？由于单套测序反应所能准确测定的靶DNA序列一般在400个碱基左右，最长可达1000个。对长约400碱基的靶DNA可以按互为相反的方向分别克隆于2种M13噬菌体载体上。然后每条链的全序列可以利用通用测序引物进行的单套反应得以测定。对长的DNA链进行测序只能将其分割成适合解读长度的片段后分段测序；然后再拼成完整的长链DNA序列。从头测序测定长片段DNA常用的方法有两种：1.随机测序法2.定向测序法随机法（鸟枪法）shotgun将长链DNA随机断裂成适于测序的片段，方法可有:超声波处理、核酸酶Ⅰ切割、限制性酶切割等；将随机切割出的子片段分别插入到载体的多克隆部位，进行克隆扩增；对不同的片段分别测序，然后将他们重叠排列，便可连出整体DNA的全长序列。或将各片段序列输入计算机处理，可整合出整个DNA序列。DNA整体切成小段小段和载体结合结合后进行测序Shotgun测序Shotgun法序列拼接ConsensusSequenceGapLowBaseQualitySingleStrandedRegionMis-Assembly(Inverted)拼接错误：Repeat的存在三、全基因组测序策略分两种策略：先作图后测序先测序后定位两种测序策略：基于BAC的方法：先把基因组打碎成200－300kb的片段并制成BAC文库，再选择一些BAC进一步打碎成3kb左右的小片段，测序并拼接。全基因组鸟枪法：把基因组直接打碎成3kb左右的小片段，测序并拼接。基于BAC的方法全基因组DNA随机打成大片段选择并克隆大片段排序，选择再打碎，克隆，测序，拼接全基因组鸟枪法基因组DNA随机打碎测序并拼接近来基因组测序技术的进展从基于BAC的策略转向全基因组鸟枪法毛细管自动测序仪的广泛使用第五节其他测序新技术基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法Matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtime-of-flightmassspectrometry，MALDI-TOF-MS杂交测序sequencingbyhybridization，SBH如寡核苷酸测序芯片MappingbyfingerprintingMappingbyhybridization焦磷酸测序技术pyrosequencing焦磷酸测序法的原理：将PCR扩增的单链DNA与引物杂交，并与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶（ATPSulfurylase）、荧光素酶（Luciferase）、三磷酸腺苷双磷酸酶（Apyrase）及底物荧光素（luciferin）和5’磷酸硫酸腺苷(APS)共同孵育。然后脱氧核糖核苷三磷酸就会按照A、C、G、T的碱基配对原则顺序连接到引物上。伴随着碱基的结合是焦磷酸盐的释放，焦磷酸盐被硫酸化酶转化为ATP，ATP就会促使氧合荧光素的合成并释放可见光(CCD检测）。由于焦磷酸盐的释放浓度与连接的碱基数一致，所以光的释放量就与每一步连接的核苷酸数量成正比。这一过程一直重复直到整个测序结束。在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团（PPi）。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。pyrosequencing第二步：加入1种dNTP第三步：化学发光第四步：降解多余底物第五步：加入另1种dNTP单分子测序法single-moleculeseguencing单分子测序法是美国LosAlames国家实验室(LANL)发展的一种通过检测标记在单个分子上的荧光进行DNA快速测序的方法。模板DNA分子首先通过酶法修饰或合成，使4种不同的荧光素标记4种不同的碱基。然后，用两个激光束(或称激光镊子lasertweezer)夹住标记的DNA分子，将其置于液流系统。从被固定的核苷酸上游端开始用外切酶逐一切下被标记的核苷酸，通过单分子荧光探测器检测液流中切下的标记核苷酸，再根据检测到的信号（时间和荧光）确定DNA顺序。原子探针显微镜测序法AtomicProbeMicroscopy80年代发展的原子探针显微镜技术如扫描遂道显微镜(ScanningTunnelingMicroscopes,STM)和原子力显微镜(AtomicForceMicroscopes,ATM)使直接检测DNA分子结构成为可能。STM是由IBMZurich研究所的科学家发明的用来直接观察单分子、单原子结构的技术，最近有人将其应用于阅读DNA序列。CompleteGenomics