DNA测序技术

DNA测序技术《工业生物技术进展》黎小军（1111005005）1994：3亿美元测定一个人类基因组(1:10)1984：30亿美元测定一个人类基因组未来目标：1000/100美元测定一个人类基因组!2004：3千万美元测定一个人类基因组(1:100)2006：1百50万美元测定一个人类基因组(1:2000)2008：50万美元测定一个人类基因组(1:6000)DNA测序技术的发展测序技术的发展•双脱氧末端终止法(Sanger测序法)–1970s同位素标记，手工–1980s荧光标记，自动–1990s毛细管电泳•合成测序法（第二代测序）–焦磷酸测序（Pyrosequencing,Roche/454）–合成测序（Sequencing-By-Synthesis,Illumina/Solexa）–连接测序（Sequencing-By-Ligation,ABI/SOLiD）•单分子测序技术（第三代测序）–Helicos–PacificBiosciences–OxfordNanoporeKeyGenomicsTechnologies1975-SouthernDNA杂交技术1977-Sanger双脱氧链终止法测序技术Maxam、Gilbert’s化学法DNA测序技术1980-自动化原位寡核苷酸合成仪1985-Cetus公司的Mullis发明PCR技术1992-Affymetrix公司（Fodor的集团）的基因芯片1995-ABI公司第一代全自动测序仪2006-第二代DNA测序仪上市2007-单分子测序技术（Singlemoleculesequencingtechniques）第一代测序技术•双脱氧链终止法测序通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。•化学降解法测序将一个DNA片段的5'端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而5'端被标记的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的DNA的碱基序列。•自动化测序与链终止法测序原理相同。只是用不同的荧光色彩标记ddNTP。如ddATP标记红色荧光。ddTTP标记绿色荧光。ddCTP标记蓝色荧光，ddGTP标记黄色荧光。由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色，而简化为由1个泳道同时判读4种碱基.第二代测序技术以高通量低成本为主要特征的第二代测序，不再需要大肠杆菌进行体内扩增，而是直接通过聚合酶或者连接酶进行体外合成测序。根据其原理又可分为两类：聚合酶合成测序和连接酶合成测序。Roche公司推出的454技术开辟了高通量测序的先河。该技术通量可达Sanger测序的几百倍，而成本却只有几十分之一，因此一经推出，便受到了国际上基因组学专家的广泛关注。Illumina公司推出的Solexa遗传分析仪是合成技术的进一步发展与延伸。该技术借助高密度的DNA单分子阵列，使得测序成本和效率均有了较大改善。同时Solexa公司提出的可逆终止子也是该技术获得认可的原因之一。与454相比，Solexa拥有更高的通量，更低的成本。虽然片段长度较短仍是主要的技术瓶颈，但是对于已有基因组的物种来说，Solexa理所当然成为第二代测序技术的首选。1、聚合酶合成测序法2007年ABI公司在Church小组研究成果的基础上推出了SOLiD测序仪。该技术的创新之处在于双碱基编码的应用，即每个碱基被阅读两次，因此大大减少了测序带来的错误率，同时可以方便的区分SNP和测序错误。在测序过程中，仪器自动加入4种荧光标记的寡核苷酸探针，探针与引物发生连接反应，通过激发末端的荧光标记识别结合上的碱基类型。2、连接酶合成测序法SOLiD测序技术流程TheDimensionsofaGeneChip5”5”Upto~6,500,000features/chip1.28cm1.28cm5µm5µm******Millionsofidenticalprobes/featureSolexa测序技术原理介绍（1）Solexa测序技术原理介绍（2）Solexa测序技术原理介绍（3）Solexa测序技术原理介绍（4）厂商RocheIlluminaABI技术454SolexaGASOLiD测序仪GS20FLXTiIIIIIx123序列数目（百万）0.50.51.252810025040115320单末端测序（Single-end）读长（bp）1002004003550100253550运行时间（天）0.250.30.4335658通量（Gb）0.050.10.515251416配对末端测序（Paired-end）读长（bp）2004002×352×502×1002×252×352×50库序列长度（kb）3.53.50.20.20.2332运行时间（天）0.30.461010121016通量（Gb）0.10.529502832Solexa和SOLiD配对末端测序所需时间和产出是单末端的两倍，454的配对末端和单末端差异在于建库方法，所需时间和测序量不变。ABISOLiD包含两张芯片，这里的数据是一张芯片的量。表1目前使用最广泛的三大第二代测序平台测序能力统计信息（2010年年初数据）个水稻基因组/天12个水稻基因组/天10个水稻基因组/天第三代测序技术近期出现的Helicos公司的Heliscope单分子测序仪、PacificBiosciences公司的SMRT技术和OxfordNanoporeTechnologies公司正在研究的纳米孔单分子技术，被认为是第三代测序技术。与前两代技术相比，他们最大的特点是单分子测序。其中，Heliscope技术和SMRT技术利用荧光信号进行测序，而纳米孔单分子测序技术利用不同碱基产生的电信号进行测序。SMRT测序技术流程表1三代测序技术特点的比较主要参考文献：[1]JayShendure,HanleeJi.Next-generationDNAsequencing.NatureBiotechnology,2008,26(10):1135-1145.[2]JonathanMRothberg,JohnHLeamon.Thedevelopmentandimpactof454sequencing.NatureBiotechnology,200826(10):1117-1124.[3]Mardis,E.R..Theimpactofnext-generationsequencingtechnologyongenetics.TrendsGenet,2008，24(3):133-41[4]RuskN.Cheapthird-generationsequencing.Nature,2009，6(4):244-245.[5]HarrisT.D.,etal.Single-moleculeDNAsequencingofaviralgenome.Science,2008，320(5872):106-109.[6]ClarkeJ.,etal.Continuousbaseidentificationforsingle-moleculenanoporeDNAsequencing.NatNanotechnol,2009，4(4):265-270.[7]MardisER.Next-generationDNAsequencingmethods.AnnuRevGenomicsHumGenet,2008,9:387-402