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第1页1绪论1.1引言螺旋霉素，英文名Spiramycin。白色或微黄色粉末，微有味；微吸湿；易溶于乙醇、丙醇、丙酮和甲醇，难溶于水。该品系多组分大环内酯类抗生素，具有强大的体内抗菌作用和抗菌后效应（PAE），能够增强吞噬细胞的吞噬作用，广泛分布于体内。本品在组织细胞内浓度较红霉素高，而副作用小于红霉素。与红霉素有交叉耐药。对革兰阳性菌和一些革兰阴性菌如链球菌、脑膜炎双球菌、百日咳杆菌、梭状芽胞杆菌等包括对青霉素、链霉素、四环素、氯霉素耐药菌均有效。螺旋霉素是多组分的抗生素，其主要成分包括螺旋霉素I、II、III。其发酵液中组分I含量最高，为60％；其次是组分II含量，为24％；最后是组分III含量，为13％。各组分活性相近。螺旋霉素是3种组分的复合物，复合物为奶油色、味苦的无定形碱性抗生素。可溶于氯仿、醇类、己烷、苯、酮、醋酸酯，微溶于水。其硫酸盐溶于水和低级醇。熔点：组分I为134～137℃：组分II为130～133℃；组分III为128～131℃。在231-232um处有紫外吸收峰，本身带有发色基团。遇浓硫酸或盐酸呈紫色反应。麦芽酚反应、茚三酮反应、坂口反应、双缩反应、斐林反应均为阴性。多年来，在我国药品市场中，抗感染药物的销售额始终位居第1，目前年销售额已达400多亿元人民币，占全国年药品销售总额的30%左右。在抗感染药物市场中，大环内酯类抗生素是主力军之一，在今后的发展中，我国的医疗保障系统将会更完善，对螺旋霉素及其衍生物的需求也会加大。2.菌种的选育2.1出发菌种的选择一般菌种分离纯化和筛选的步骤如下：第2页用产二素链霉菌SIPI9004生产螺旋霉素。2.2筛选培养基和培养条件琼脂培养基/%：葡萄糖1.5，黄豆饼粉1.0，麸皮1.0，MgSO4・7H2O0.05，CaCO30.3，琼脂2.0；pH7.0，28℃培养12d。种子培养基：葡萄糖，淀粉，黄豆饼粉，酵母粉，NaCl，CaCO3；pH7.0，斜面孢子挖块接种，摇瓶置于旋转摇床(230r/min)，28℃培养48h。发酵培养基：淀粉，鱼粉，酵母粉，NaCl，NaNO3，KH2PO4，CaCO3；pH6.5，取种子培养液10%移种于发酵摇瓶中，摇床(230r/min)，28℃培养120h。2.3测定方法总糖：用费林法测定。菌体浓度：取发酵液10ml置于刻度离心管中，离心(3000rmin)10min，测定菌丝体湿重。发酵单位：取发酵滤液用杯碟法测定，藤黄八叠球菌为检定菌。2.4菌种处理单孢子悬浮液制备：新鲜孢子斜面加入无菌生理盐水，洗下的孢子经滤纸过滤，镜检单孢子分散度达到97%以上方可用于诱变处理。2.5菌种诱变吸取单孢子悬浮液6ml培养皿，置于30W的UV灯(253.7nm)下30cm处，振动照射处理，杀死率控制在90%左右。2.6初筛用氨基乙酸和缬氨酸作为筛选剂，以适当浓度分别加至琼脂培养基中，制成不含药物平板及药物浓度梯度平板。将诱变后存活孢子涂布于上述平板上，恒温培养；UV处理的和不处理的孢子，分别涂布于不含药物的琼脂培养基平板上培养作对照。分别选取单菌落传斜面培养。采样材料预处理分离所需菌种培养菌种菌落选择菌种初筛菌种复筛性能鉴定菌种保藏第3页2.7摇瓶复筛斜面挖块移种种子瓶培养；以10%接种量移种发酵瓶发酵培养，发酵滤液作生物效价测定，去劣留优。2.8高产菌株高产菌株为突变的产二素链霉菌SIPI9004生产螺旋霉素。3菌种保藏菌种的保藏方法有：斜面菌种低温保藏法、砂土管保藏法、甘油封藏法、真空冷冻干燥法、液氮超低温保藏法。真空冷冻干燥法：是目前比较理想的一种方法。在低温-15°C下，快速将细胞冻结，并保持细胞完整，然后在真空中使水分升华至干。在此环境下，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异，故可长时间保存，一般为5-10年，最多可达15年之久。此法兼备了低温、干燥及缺氧几方面条件，使微生物可以保存较长时间，但过程较麻烦，需要一定的设备。产二素链霉菌遗传极不稳定，在培养过程或菌株保藏中，常发生变异，故采用真空冷冻干燥法。4培养基的配置4.1配制培养基的原则培养基是指可供微生物细胞生长繁殖所需的一组营养物质和原料，同时也为微生物生长提供除营养外的其他生长所需的条件。原则上①满足必须的原料；②生化反应的基本条件（温度、溶氧和批pH）；③来源丰富、价格低廉、取材方便、质量稳定；④培养基成分不影响下游产品的提取加工。4.2培养基类型培养基可以按照用途可以分成孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。4.2.1孢子培养基孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基。第4页4.2.2种子培养基种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长的粗壮，成为活力强的“种子”。4.2.3发酵培养基发酵培养基既要有利于生长繁殖，防止菌体过早衰老，又要有利于产物的大量合成。4.3发酵培养基的与培养条件孢子培养基琼脂培养基%：葡萄糖1.5，黄豆饼粉1.0，麸皮1.0，MgSO4・7H2O0.05，CaCO30.3，琼脂2.0；pH7.0，28℃培养12d。种子培养基(g/L)淀粉30，黄豆饼粉20，葡萄糖5，磷酸二氢钾0.5，蛋白胨6，豆油5，氯化钠4。以温度28±0.5℃，220r/min培养。发酵培养基(g/L)淀粉70，黄豆饼粉15，玉米浆7，动物蛋白NY5，糊精12，氯化钠4，硝酸铵6，碳酸钙5，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁1，豆油3。以温度28±0.5℃，接种量8%，220r/min培养96h。4.3.1碳源碳源是组成培养基的主要成分之一，其主要功能有两个：一是为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合成菌体所必须的碳成分；二是为合成目的产物提供所需的碳成分。发酵条件研究发现：不同碳源中以淀粉最好，糊精次之，最差是蔗糖和乳糖。本设计中发酵培养基所用碳源为淀粉与葡萄糖。4.3.2氮源氮源主要用于构成菌体细胞物质和含氮代谢物。常用的氮源分为有机氮源和无机氮源。本设计的发酵培养基中的有机氮源是黄豆饼粉、玉米浆和鱼粉；无机氮源是硝酸铵。4.3.3无机盐和微量元素无机盐和微量元素是生理活性物质的组成成分或具有生理调节作用，磷（核酸）、硫、铁（细胞色素）、镁、钙（调节细胞膜透性）、锰、铜、锌（辅酶或激活剂）、钴、钾、钠（调节渗透压）、氯。一般低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用。第5页4.3.4水水是所有培养基的主要组成成分，是生命活动不可或缺的物质，是细胞的主要成分，良好的介质，营养传递的道体，调节细胞生长。4.3.5生长因子生长因子是指氨基酸、核苷酸、维生素、脂肪酸等菌体必须地生理活性物质。在这种天然培养集中已然含有无需添加。4.3.6前体物质在抗生素发酵过程中加入前提物可以控制菌体合成抗生素的方向和增加抗生素的产量。在螺旋霉素发酵中不同的前体物对发酵有不同的影响。本设计采用正丙醇作为前体。在20h补加0.5%正丙醇。4.3.7消泡剂在发酵的过程中会有泡沫的出现，需要添加消泡剂进行消泡。本设计中含有的豆油，可作为消泡剂。5.灭菌灭菌是指利用物理或化学方法杀灭或除去物料及设备中的一切有生命物质的过程。常用的灭菌方法有：化学灭菌法，射线灭菌法，干热灭菌法，湿热灭菌法，过滤除菌法。5.1培养基灭菌为减少对培养基的破坏，采用湿热灭菌。培养基的湿热灭菌还分分为：培养基的分批灭菌和连续灭菌。分批灭菌设备简单，易操作，但是计算难，耗时长，对培养基的破坏比较大。连续灭菌在不同的温度下分开灭菌，减少了培养基受热破坏的程度，灭菌时间短，提高了设备的利用率。本设计采用湿热连续灭菌对培养基进行灭菌。5.1.1连续灭菌的设备①配料预热罐，将配好的料液预热到60～70℃，以避免灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声；②连消塔，连消塔的作用主要是使高温蒸汽与料液迅速接触混合，并使料液的温度很快升高到灭菌温度；第6页③维持罐，是一个直立圆形容器，附有进出料管道，保温时，培养基由进料口连续进入维持罐底部，液面不断上升，离开罐后流入冷却器。④喷淋冷却器，一般安装在室外，顶端装有带齿轮的水槽，冷却水从水槽内溢出沿下方的管壁以膜状依次流下。培养基从下部进入，从上部排出由分配站进入发酵罐。5.1.2连续灭菌的流程图5-1-2连续灭菌的流程图培养基在采用连续灭菌时，发酵罐应该在连续灭菌前先进行空罐灭菌，通常先把发酵罐的空气过滤器灭菌并用空气吹干。加热器、维持罐及冷却设备也应先行灭菌。组成培养基的不同成分可以在不同的温度下分开进行灭菌，以减少培养基受热破坏的程度。连续灭菌时，培养基在短时间内被加热到131℃，短时间保温8min后，被快速冷却，在进入早已灭菌完毕的发酵罐。（1）配料配料罐用于培养基的配置。然后将培养基用泵打入预热桶中。、（2）预热预热桶的作用一是定容，二是预热。预热的目的是使培养基在后续的加热过程中能快速的升到指定的灭菌温度，同时避免太多的冷凝水带入培养基，还可减少震动和噪声。一般可将培养基预热到70～90℃.（3）预热好的培养基由连消泵打入加热器。加热器也称连消塔，使培养基与蒸汽混合并迅速达到灭菌温度。加热采用的蒸汽压力一般为0.45～0.8MPa，其目的是使培养基在较短时间（20～30s）里快速升温。加热器有塔式加热器和喷射加热器两种。（4）保温保温是将培养基维持灭菌温度一段时间，使杀灭微生物的主要第7页过程。其设备有维持罐和管事罐两种。保温设备一般采用保温材料包裹，但不直接通入蒸汽。（5）降温升降温快是连续灭菌的主要特征之一，为避免培养基营养成分的破坏，保温后的培养基需要迅速降温至接近培养温度（40～50℃）.国内大多采数用喷淋冷却设备，也有采用螺旋板式换热器、板式换热器、真空冷却器等。反应根据培养基的特点、处理量、场地特性选用喷淋冷却设备。5.2发酵罐灭菌空罐灭菌方法：从有关管道通入蒸气，使罐内蒸气压力达0.147MPa，维持45min。灭菌过程从有关阀门，边阀排除空气，并使蒸气通过达到死角灭菌。灭菌完毕，关闭蒸气后，待管内压力低于空气过滤器时，通入无菌空气保压0.098MPa。5.3空气除菌空气中的微生物主要是细菌、酵母菌、霉菌和病毒，它们大多附着在空气中的灰尘上。5.3.1空气的预处理图为空气净化系统流程图，把这一流程中过滤器以前的部分称为空气的预处理。图5-3-1空气除菌设备流程图采风塔：采风塔建在工厂的上风头，远离烟囱，采风塔可用灰铁皮或砼制成。采风塔越高越好，至少10m，气流速度为8m/s。粗过滤器：安装在空压机吸入口前，主要作用是拦截空气中较大的灰尘以保护空气压缩机，同时起一定的除菌作用，减轻总过滤器的负担。应阻力小，容量大。第8页空气压缩机：作用是提供动力，以克服随后各设备的阻力。本设计采用往复式空压机。空气贮罐：作用是消除压缩空气的脉动，空气贮存，降温，保证稳定的出口压要求：H/B=2～2.5，V=（0.1～0.2）VA其中，H为罐高；B为罐直径；VA为空压机每分钟排气量（20℃，1×105Pa状况下），3m冷却器：空压机出口温度气温在120℃左右，必须冷却。另外在潮湿的地域和季节还可以达到降湿的目的。空气冷却器可采用列管式热交换器空气走壳程，管内走冷却水。旋风分离器：是利用离心力进行气-固或气-液沉降分离的设备。它结构简单、阻力小、分离效率高。丝网除沫器：利用惯性拦截原理。对1μm以上的雾滴除去率98％。空气加热设备：压缩空气加热设备一般采用列管换热器，空气走管程，蒸汽走壳程，换热系数一般为160W/（m2·℃）。5.3.2空气的过滤除菌大型的发酵工厂常采用两级或者三级过滤器，本设计采用两级过滤器，第一级过滤器称为总过滤器，二级为分过滤器。总过滤器：纤维及颗粒状介质过滤器，介质为玻璃纤维和活性炭颗粒。纤维层：活性炭层：纤维层高度为1：1：1—1：2：1，介质层总高度为0.3—1.0m。分过滤器：微孔膜过滤器，它是由耐高温、疏水的、厚度为150μm的聚四氟乙烯薄膜构成，能够清除所有大于0.01μm的微粒，能清除几乎所有空气中夹带的微生物。第9页5.3.3无菌空气的检验空气系统的无菌检测主要考察过滤器是否失效。过滤器失效的检测方法之一是检测过滤器两侧的压降，