代谢组学及其技术规范

代谢组学及其技术规范指导教师:教授副教授学生：专业：本草生物学2016.7.20代谢组学PART1总结展望PART3目录CONTENT技术规范PART2研究内容PART42/451代谢组学1.1概述1.2代谢组学分析技术1.3代谢组学数据分析与处理1.4代谢组学与中医药1.5代谢组学的应用3/45核心思想：运用现代分析技术定量地测定生物体在不同状态下（生理病理状态、药物干预前后等）参与物质传递、能量代谢和信息传导等代谢调控的小分子代谢物质即代谢物组的变化，并利用模式识别将这种应答与体内生物学事件相关联，定位事件发生的靶器官，从而确定生物标记物，表征或揭示生物体在特定时间、环境下整体的功能状态。1.1概述代谢组学是继基因组学，蛋白质组学之后，从整体的角度，通过研究生物体、器官或组织的内源性代谢物质的代谢途径及其所受内在环境因素影响及随时间变化规律的一门新兴学科。研究对象代谢物靶标分析：某一类结构性质相关的化合物。代谢物指纹分析：同时对多个代谢物进行分析，不分离鉴定具体单一组分。代谢物轮廓分析：限定条件下对生物体内特定组织内的代谢产物的快速定性和半定量分析。代谢组分析：对生物体或体内某一特定组织所包含的所有代谢物的定量分析并研究该代谢物组在外界干预或病理生理条件下的动态变化规律。4/45代谢组学研究现状代谢组学自从出现以来，引起了各国科学家的极大兴趣，短短10年来取得了突飞猛进的发展，相关科研论文发表数量从1999年的1篇到现在每年1200多篇是数量增长，主要发表在JPR,、JCB,、PLoSONE、JPBA等杂志上，权威科学杂志Nature迄今已有3篇代谢组学相关文章发表。国内CNKI也从2003年的几篇综述开始到现在已有上千篇出版，并已有相关书籍出版。中科院大连化物所（许国旺）中科院武汉物理数学研究所（唐慧儒）中南大学（梁逸曾）清华大学（罗国安）上海交通大学（贾伟）等帝国理工大学（JerenyK.Nicholson)莱顿大学（VanderGreef)美国加州大学Davis分校普渡大学杜克大学等。国外国内5/45NMRGC-MSLC-MS检测动态范围宽快速、无损灵敏度低1.2代谢组学分析技术检测动态范围宽灵敏度高利于快速定量分析灵敏度高用于挥发性物质检测检测动态范围窄6/451.3代谢组学数据分析与处理样本的采集化合物种类多样化浓度动态范围大理化性质复杂化仪器稳定性、精密度、重现性、灵敏度代谢物分析的全面性谱峰的校准、归一化、重叠、数据的标准化代谢轮廓空间距离的判别样本的分析多元统计分析代谢物鉴定生物学意义阐释已知及未知代谢物的鉴定代谢物的去卷积同分异构体的识别代谢通路的分析样本的制备图1基于GC-MS尿液代谢组学研究沙棘籽油的抗抑郁作用7/45图2人体血浆的1HNMR谱图谱图的采集图3人体血浆样本GC-MS总离子色谱图（TIC）图4正离子模式下各组人体血浆代谢物LC-MS总离子流图图5负离子模式下各组人体血浆代谢物LC-MS总离子流图8/45多元统计分析是从经典统计学中发展起来的一个分支，是一种综合分析方法，它能够在多个对象和多个指标互相关联的情况下分析它们的统计规律。主要内容包括多元正态分布及其抽样分布、多元正态总体的均值向量和协方差阵的假设检验、多元方差分析、直线回归与相关、多元线性回归与相关(Ⅰ)和(Ⅱ)、主成分分析与因子分析、判别分析与聚类分析、Shannon信息量及其应用。多元统计分析9/45多元统计分析主成分分析（PCA）偏最小二乘-判别分析（PLS-DA）正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）可以在不具备样品任何分组信息的情况下对数据进行降维处理，使得样本代谢表型的内在关系变得可视化。在明确样品分类信息的前提下，寻找已知组别间的变量差异或变量之间的相关关系，找出样品分离的最大差异，从而最大程度地反映分类组别之间的差异。在PLS-DA基础上，去除噪音信息，最大化程度地提取与实验有关的变化来寻找两组之间的差异代谢物。聚类分析SIMICA-PMATLAB10/45代谢物的鉴定NMR经验解谱（一维和二维核磁谱图结合）HMDB数据库现有文献GC-MS标品对照NIST数据库HMDB数据库LC-MS标品对照HMDB、MassBank、C-Clound数据库已发表文献.11/45生物意义阐述KEGGHMDB已有文献12/45图6差异代谢物含量热点图（Class1,健康对照下；Class2，抑郁症组，Class3逍遥散组，色带-4-4代表代谢物含量由高到低）相关分析13/45ROC曲线分析ROC曲线用于临床诊断：ROC曲线下的面积值在1.0和0.5之间。在AUC0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5-0.7时有较低准确性，AUC在0.7~0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。AUC=0.5时，说明诊断方法完全不起作用，无诊断价值。AUC0.5不符合真实情况，在实际中极少出现。14/451.4代谢组学与中医药西医药治疗不良反应比较多药物价格比较高作用靶点较单一长期用药风险大服药依从性不高理想替代治疗不良反应较少作用靶点较多治疗价格便宜适合长期服用服药依从性高传统中医药治疗成分较多，靶点较多经验用药，配方灵活资源丰富，价格便宜不良反应相对少而轻整理调节，安全有效15/451.4代谢组学与中医药中医理论巨系统且复杂中药复方物质基础不明确代谢组学代谢通路生物标志物临床诊断作用机制整体性动态性辩证性16/45新药的筛选和开发1药物作用机制研究2疾病诊断与发生机制研究4药物毒性评价3植物细胞代谢组学研究5微生物代谢组学研究61.5代谢组学的应用17/452技术规范2.1实验设计2.2样本前处理方法2.3数据处理2.4代谢物的鉴定2.5代谢通路分析18/452.1实验设计动物实验12h禁食不禁水收集分装临床实验诊断排除12h禁食不禁水中断晨尿静脉血19/452.2样本前处理方法考察条件变化因素峰面积变化CV(a)30%样本收集在4℃凝结1,6,24h17.65%在25℃凝结I,6,24h44.8%抗凝剂肝素钠vs.EDTAvs.柠檬酸钠66%样本处理离心时间I5minvs.30min8.3%样本储存血清储存于4℃6,12,24,48h7.1%血清储存于25℃6,12,24,48h10%血浆储存于4℃6,12,24,48h7.1%血浆储存于25℃6,12,24,48h10%血清储存于-80℃1,3,6个月3%冷冻/解冻循环1,5,10次2.9%分装20/45提取溶剂系统：甲醇/氯仿/水萃取次数：一步萃取；两步萃取生物组织前处理方法优化OnestepTwostep极性部分非极性部位2.2样本前处理方法21/452.3数据处理1.•导入原始的连续数据集2.•峰对齐，纠正不同分析运行间的保留时间偏移3.•色谱峰归一化，以便在不同样品运行间进行比较4.•色谱峰检测(峰选择)5.•离子去卷积，按化合物将离子分组6.•利用已有的定制数据库进行化合物鉴定7.•执行数据分析22/45数据处理软件：免费软件：XCMS、MetAlign和MZmine等商品化软件：WaterMarkerlynx、TransOmics、MassHunter和ChromaTOF等自主开发设计的软件（基于Matlab或R语言）：MetSign(AnalChem.2011Oct15;83(20):7668-75.)2.3数据处理23/452.3数据处理RAW文件CDF文件csv文件R软件excel文件SIMCA-PGC-MSNMR代谢组学，采用MestReNova软件进行此部分数据处理LC-MS代谢组学，一般有工作站自带网站进行处理24/452.4代谢物的鉴定NMR经验解谱（一维和二维核磁谱图结合）HMDB数据库现有文献GC-MS标品对照NIST数据库HMDB数据库LC-MS标品对照HMDB、MetAlign、C-Clound数据库已发表文献.25/452.5代谢通路分析D-GlucoseKEGGMetPA……ChemicalID≠BiochemicalID代谢通路如何准确定位以D-Glucose为例26/45LabelingschemefortheKrebscyclewithpyruvatecarboxylationusing[U–13C]-glucoseastracer.Withoutlabeledtracers,itisimpracticaltoresolvethespecificpathway(s)involvedintheirproduction.2.5代谢通路分析JBiomolNMR(2011)49:267–280.27/453总结展望代谢组学是组学领域里唯一的表观测量，分析仪器飞速发展，达到了前所未有的快速、灵敏、可靠和自动化，使得代谢组学中大数据集的结果更加可靠。对于样本的收集、处理以及检测等缺乏统一的标准，给代谢组学研究带来一定的困扰。结合转录组学、蛋白组学及基因组学以及网络药理学等相关系统生物学技术和方法进一步深入剖析疾病发生以及治疗机制已经成为一种趋势。12328/454研究内容4.11HNMR代谢组学研究逍遥散的抗抑郁疗效4.21HNMR代谢组学研究驴胶补血颗粒补血作用机制4.3GC-MS代谢组学研究沙棘籽油的抗抑郁作用4.4GC-MS代谢组学研究逍遥散的抑郁症疗效4.5LC-MS代谢组学研究逍遥散的抑郁症疗效4.6临床血浆样本中OT、PGE2、PEF2α的LC-MS测定29/454.11HNMR代谢组学研究逍遥散的抗抑郁疗效图1人体血浆1HNMR谱图图2三组人体血浆样本的PLS-DA散点图图3健康对照组以及抑郁症患者治疗前后的OPLS-DA散点图以及S-Plots图4与逍遥散抗抑郁作用相关的代谢通路图Fig.4.与逍遥散抗抑郁相关的潜在生物标志物ROC曲线分析.(A)lactate;(B)TAMO;(C)phenylalaine.30/4531/484.21HNMR代谢组学研究驴胶补血颗粒补血作用机制图1大鼠血清1HNMR谱图31/4532/484.3GC-MS代谢组学研究沙棘籽油的抗抑郁作用32/4533/484.4GC-MS代谢组学研究逍遥散的抑郁症疗效图1各组人体血浆样本GC-MS总离子色谱图（TIC）图2健康对照组以及抑郁症患者服药前后血浆代谢物的PLS-DA散点图（左）及其模型验证图（右）图3健康对照组与抑郁症患者血浆代谢物的OPLS-DA图（A）以及s-plot（B）图4抑郁症患者服药前后样本（训练集）OPLS-DA散点图(a)以及相应的S-plot图（b）；抑郁症患者服药前后样本（验证集）OPLS-DA散点图（c）以及相应的相应的S-plot图（d）33/45差异代谢物及相关代谢通路分析精氨酸和脯氨酸代谢乙醛酸和二羧酸盐代谢脂肪酸的生物合成缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成34/45GC-MS测得血浆异代谢物ROC曲线分析图1训练集(A)以及验证集(B)中草酸和硬脂酸的ROC曲线图表1差异代谢物ROC曲线下面积Liu,Cai-Chun,etal.EvaluatingtheTherapeuticEffectsofXiaoyaosaninDepressedPatientsUsingGasChromatographyMassSpectrometry(Phytomedicine,underreview).35/454.5LC-MS代谢组学研究逍遥散的抑郁症疗效LC-MS谱图图1正离子模式下各组人体血浆代谢物LC-MS总离子流图图2负离子模式下各组人体血浆代谢物LC-MS总离子流图36/4537/48图3正负离子模式下四组血浆样本的PLS-DA散点图（A）及其模型验证图（B）；负离子模式下四组血浆样本的PLS-DA散点图（C）及其模型验证图（D）多元统计分析PLS-DA散点图中，正负离子模式下逍遥散组均介于抑郁症组和健康对照组之间，表明逍遥散具有明显的抗抑郁症疗效。模型验证图中，正负离子模式下回归线斜率较大而且Q2＜0，表明