酶定向进化

第八章酶定向进化（一）教学目的与要求：1、掌握：酶定向进化的特点。2、熟悉：酶基因的随机突变。3、了解：酶突变基因的定向选择。（二）教学重点：易错PCR技术、ＤＮＡ重排技术、交错延伸PCR技术、随机引物体外重组技术、基因家族重排技术概念及特点。难点：酶基因的随机突变。（三）课时安排：2课时（四）教学方法：讲授法；多媒体教学•1993年,美国科学家ArnoldFH首先提出酶分子的定向进化的概念,并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶.定向进化•定向进化是模拟自然进化的过程，进行人工随机突变，并在特定的环境条件下进行选择，使进化朝着人们所需要的方向发展的技术过程。•分为分子定向进化和细胞定向进化细胞定向进化•细胞定向进化是在细胞水平上进行定向进化的过程，以各种细胞为进化对象，通过人工随机突变，改良细胞的各种特征，主要包括微生物细胞的定向进化、动物细胞的定向进化、植物细胞的定向进化等。分子定向进化•分子定向进化是在分子水平上进行定向进化的过程。通过从细胞内提取或者通过PCR等方法获得目标分子的基因，在体外进行人工随机突变，然后进行定向选择而获得所需突变体。酶分子定向进化•简称酶定向进化，是模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择具有优良催化特征的酶的突变体的技术过程。酶定向进化的基本过程酶基因随机突变构建突变基因文库筛选负突变基因正突变基因进化酶反复进行第一节酶基因的随机突变1、易错PCR技术2、ＤＮＡ重排技术3、基因家族重排技术•基因随机突变方法的特点P207表8－1•随机突变方法可以联合使用，交叉进行，通过多次试验，反复筛选，以完成对酶的定向进化。一、易错PCR技术•从酶的单一基因出发，在改变反应条件的情况下进行聚合酶链式反应（PCR），使扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。•可以通过提高镁离子浓度、添加一定浓度的锰离子、改变4种底物（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）的浓度比等反应条件，使DNA聚合酶在催化基因扩增时，增加碱基配对错误的出现频率。特点•基因突变发生在单一分子内，为无性进化。•操作简便、随机突变丰富。•正突变的概率低，突变基因文库较大，文库筛选的工作量大，一般适用于较小基因的定向进化。•因此要控制好突变率，一般一个目的基因错配碱基数目应控制在2~5个二、DNA重排技术•由美国Stemmer于1994年首次提出一项体外重组技术•概念：又称为DNA改组技术，是从正突变基因文库中分离得到同源DNA，用酶切割成随机片断，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。DNA重排技术的基本过程两条以上正突变基因DNA随机片断突变基因构建突变基因文库筛选负突变基因正突变基因进化酶酶切（反复进行）无引物PCR基因重组酶切•DNA重排技术将两条或多条正突变基因通过脱氧核糖核酸酶Ⅰ（DNaseⅠ)等酶的作用，随机切割成若干DNA片断，然后将这些随机片断在不加引物的条件下经过多次PCR循环，使这些DNA随机片断互为模板和引物进行扩增、延伸，再加入适宜的引物进行PCR反应，获得全长基因。•这些全长基因由于是在不加引物的条件下由DNA随机片断互为模板和引物扩增而成的，其碱基序列经过重新排布而形成众多的突变基因。特点•DNA重排技术将两条或多条正突变基因结合在一起，通过碱基重排形成新的突变基因，为有性进化•正突变率高，进化速度较快。（DNA重排技术是在原有正突变的基础上进行）•操作过程要去除DNaseⅠ，使操作复杂化。•1）交错延伸PCR技术：•在同一个反应体系中以两个或多个相关的DNA片断为模板进行PCR反应，把PCR反应中常规的退火和延伸合并为一步，缩短反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基因长度。交错延伸PCR技术特点•省去了用DNA酶切割成片段这一步，简化了DNA重排方法。•交错延伸法重组发生在单一试管中，不需分离亲本DNA和产生的重组DNA。•2）随机引物体外重组技术•采用单链DNA为模板，配合若干条随机序列的引物进行PCR反应，产生若干个与模板不同部分的序列互补DNA小片断，然后除去模板，这些DNA小片断互为模板和引物进行扩增，通过碱基序列的重新排布而获得全长突变基因。三、基因家族重排技术•概念：又称为基因家族改组技术，是从基因家族的若干同源基因出发，用酶(DNaseⅠ)切割成随机片断，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列发生重新排布而引起基因突变的技术过程。基因家族：是来源于同一个祖先，由一个基因通过基因重复而产生两个或更多的拷贝而构成的一组基因，它们结构相似、功能相关、进化上同源。基因家族重排技术的基本过程基因家族若干同源基因酶切DNA随机片断突变基因突变基因文库基因重组筛选负突变基因正突变基因进化酶无引物PCR酶切反复进行DNA家族重排技术与DNA重排技术的异同点•相同点：DNA家族重排技术与DNA重排技术的过程大致相同，都要经过基因的随机切割、无引物PCR等步骤以获得突变基因，然后经过构建突变基因文库、采用高通量筛选技术筛选获得正突变基因。•不同点：DNA家族重排技术从基因家族的若干同源基因出发进行DNA序列的重新排布，而DNA重排技术则从采用易错PCR等技术所获得的两个以上的正突变基因出发进行DNA序列的重新排布。第二节酶突变基因的定向选择•突变基因的定向选择基本过程突变基因基因载体突变基因文库基因重组筛选目的基因一、酶突变基因文库的构建•（一）构建基因文库的质量要求•1、文库的包容性:指构建的文库必须尽可能地包含基因的任何一种可能的突变信息。•2、文库的完整性：指文库中包含的DNA片断必须尽可能完整地反应基因的结构和功能信息，以便通过筛选得到的突变基因能够通过表达获得完整的具有催化功能的进化酶。（二）构建突变基因文库的主要过程1、载体的选择载体的基本特点:•能自主复制；•具有2个以上的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定；•有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；•分子量小，以容纳较大的外源DNA。1）质粒载体：质粒载体是人工改造后的质粒，具有自主复制起点、两种以上易于检测的选择性标记、多种限制性内切酶的单一位点等特点。.ori复制起点.tctr四环素基因.Ampr氨苄青霉素抗性基因.P启动子T终止子（二）构建突变基因文库的主要过程2）噬菌体DNA载体：由噬菌体DNA改造而成的具有自我复制能力的载体。3）黏粒载体：是一类人工构建的含有λDNA黏性末端和质粒复制子的质粒载体，又称为柯斯质粒。4）噬菌粒载体：是一类人工构建的由M13噬菌体单链DNA的基因间隔区与质粒载体结合而成的基因载体。2、基因重组在体外通过DNA连接酶的作用，将基因与载体连接在一起形成重组DNA的技术过程。黏性末端连接平头末端连接修饰末端连接黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。平末端平末端SmaI限制酶的切割当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。3、形成基因文库将重组DNA转入受体细胞或包装成有感染活性的噬菌体的过程。重组质粒载体：转化重组噬菌体DNA载体：需要用噬菌体外壳蛋白将重组DNA进行包装，称为有感染活性的重组噬菌体，而形成基因文库。二、突变基因的筛选•（一）定向选择环境条件的设定•（1）提高酶的稳定性，高温筛选重组细胞，每一次突变－筛选的循环中逐步提高重组细胞的培养温度。•（2）如果定向进化的目的是提高β－内酰胺酶的活性，从而提高对β－内酰胺酶类抗生素的耐受性，可以通过在含有一定浓度的β－内酰胺酶类抗生素的培养基中培养重组细胞，并在每一次突变－筛选循环中逐步提高抗生素的浓度。•（二）高通量筛选技术P217表8－21、平板筛选法•平板筛选法所依据的重组细胞的表型包括细胞生长情况、颜色变化情况、透明圈情况。1）依据细胞生长情况筛选突变基因在提高酶的热稳定性、抗生素耐受性、pH稳定性和对其他极端环境条件的耐受能力等方面有广泛应用。2）依据颜色变化筛选突变基因（1）在采用噬菌体DNA载体构建突变基因文库时，可以用大肠杆菌β－半乳糖苷酶的基因片断（lacZ′）插入到噬菌体DNA的间隔区域中，当它感染了相应的大肠杆菌宿主细胞时，在含有IPTG和底物X－gal的平板培养基上可以形成蓝色噬菌斑。（2）在对磷酸酯酶进行定向进化的过程中，可以在平板培养基中加入硝基酚磷酸，接种重组细胞培养一段时间后，有些重组细胞周围出现黄色（硝基酚）。3）依据透明圈情况筛选突变基因依据透明圈情况筛选突变基因是在平板培养基中加入目的酶的作用底物，然后接种重组细胞，在一定条件下进行培养，培养一段时间后，在一些重组细胞的菌落周围会出现较大的透明圈。第三节酶定向进化的特点1适应面广2目的性强3效果显著第四节酶定向进化的应用•P221表8－3一、提高酶的催化效率二、增加酶的稳定性三、改变酶的底物特异性思考题1何谓酶的定向进化？有何特点？2酶基因随机突变的三种方法？3易错PCR技术的概念及其主要过程。4DNA重排技术的概念及其主要过程。5基因家族重排技术及其主要过程。