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实时实时实时实时荧光定量荧光定量荧光定量荧光定量PCR技术原理技术原理技术原理技术原理王秋泉王秋泉王秋泉王秋泉FieldApplicationScientistTel:8008208982/4008208982什么是实时荧光定量什么是实时荧光定量什么是实时荧光定量什么是实时荧光定量什么是实时荧光定量什么是实时荧光定量什么是实时荧光定量什么是实时荧光定量PCR?PCR?•一种实时监控核酸扩增的技术在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化对PCR过程进行实时监控，以此实现对初始模板的定量分析。2LifeTechnologies定量定量定量定量定量定量定量定量PCRPCR如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作??PCR•PCR反应液加入了各种类型的荧光标记物3一个PCR循环LifeTechnologies定量定量定量定量定量定量定量定量PCRPCR如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作??•在扩增过程中,荧光信号随着PCR产物的增加而增强4PCRPCR大量大量大量大量PCR产产产产物物物物PCR产物LifeTechnologies•无论是哪个型号,所有的定量PCR仪器都有三个共同的组成部分定量定量定量定量定量定量定量定量PCRPCR如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作??2.光源51.热循环模块3.检测器LifeTechnologies定量定量定量定量定量定量定量定量PCRPCR如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作??•每个循环结束后,定量PCR仪器通过光学系统记录荧光信号的增加6循循循循环环环环1滤滤滤滤光片光片光片光片A样样样样品品品品1Level:LifeTechnologies•最后,定量PCR软件计算出数据，用于实验结果的分析定量定量定量定量定量定量定量定量PCRPCR如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作如何工作??7LifeTechnologies定量定量定量定量定量定量定量定量PCRPCR的化学原理的化学原理的化学原理的化学原理的化学原理的化学原理的化学原理的化学原理8定量定量定量定量定量定量定量定量PCRPCR的化学原理的化学原理的化学原理的化学原理的化学原理的化学原理的化学原理的化学原理LifeTechnologies两种化学方法两种化学方法两种化学方法两种化学方法两种化学方法两种化学方法两种化学方法两种化学方法染料法染料法染料法染料法染料法染料法染料法染料法TaqManTaqMan探针法探针法探针法探针法探针法探针法探针法探针法9LifeTechnologies•TaqMan水解探针：5′端荧光报告基团与靶基因特异性结合的序列3′端荧光淬灭基团TaqManTaqMan探针法探针法探针法探针法探针法探针法探针法探针法10报告基团报告基团报告基团报告基团淬灭基团淬灭基团淬灭基团淬灭基团LifeTechnologies•完整的探针：检测不到报告荧光TaqManTaqMan水解探针作用机理水解探针作用机理水解探针作用机理水解探针作用机理水解探针作用机理水解探针作用机理水解探针作用机理水解探针作用机理•切断的探针：检测到报告荧光11能量激发光激发光荧光共振能量转移，FRETLifeTechnologies变变性性(95(95ºC)ºC)12LifeTechnologies退火退火(60(60ºC)ºC)13LifeTechnologies14LifeTechnologies15LifeTechnologies16LifeTechnologies17LifeTechnologies18LifeTechnologies?19LifeTechnologiesTaqisspecial...5′-3′外切酶活性外切酶活性外切酶活性外切酶活性20水解探针水解探针水解探针水解探针，，，，使报告基团和淬使报告基团和淬使报告基团和淬使报告基团和淬灭基团分离灭基团分离灭基团分离灭基团分离LifeTechnologies21LifeTechnologies22LifeTechnologies23LifeTechnologies24LifeTechnologies25LifeTechnologies26LifeTechnologies27LifeTechnologies28LifeTechnologies29LifeTechnologies30LifeTechnologies31LifeTechnologies32LifeTechnologies33LifeTechnologies34LifeTechnologies35LifeTechnologies36LifeTechnologies37LifeTechnologies38LifeTechnologies39LifeTechnologiesBurp!40LifeTechnologies实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化荧光41荧光循环数LifeTechnologies报告荧光:6-FAM、JOE、VIC、NED、CY3、TexasRed、CY5淬灭荧光:MGB-NFQ、TAMRA、BHQ参比荧光:ROX荧光标记组合荧光标记组合荧光标记组合荧光标记组合荧光标记组合荧光标记组合荧光标记组合荧光标记组合42常用的荧光组合：FAM目的基因1VIC目的基因2/内对照NED目的基因3ROX参比荧光LifeTechnologies荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合•7300实时荧光定量PCR系统ChannelDyeExamplesExcitationWaveLenthghEmissionWaveLenthgh1FAM™,SYBR®455~485nm~520nm2VIC®,JOE™~550nm3NED™，TAMRA™~580nm4ROX™~620nm43•7500实时荧光定量PCR系统ChannelDyeExamplesExcitationWaveLenthghEmissionWaveLenthgh1FAM™,SYBR®455~485nm~5202VIC®,JOE™510~530nm~5503NED™,Cy3，TAMRA™540~550nm~5804ROX™,TexasRed®570~590nm~6105CY5Dye™630~650nm~650LifeTechnologies荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合•StepOne™实时荧光定量PCR系统ChannelDyeExamplesExcitationWaveLenthghEmissionWaveLenthgh1FAM™,SYBR®455~485nm~5202VIC®,JOE™510~530nm~5503ROX™570~590nm~62044•StepOnePlus™实时荧光定量PCR系统ChannelDyeExamplesExcitationWaveLenthghEmissionWaveLenthgh1FAM™,SYBR®455~485nm~5202VIC®,JOE™510~530nm~5503NED™，TAMRA™540~550nm~5804ROX™,TexasRed®570~590nm~620LifeTechnologies荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合荧光染料组合•7900HT实时荧光定量PCR系统ChannelDyeExamplesExcitationWaveLenthghEmissionWaveLenthgh1FAM™,SYBR®Green488nm~520nm2TET™~540nm3JOE™,VIC®~550nm4NED™~570nm5TAMRA™~580nm6ROX™~610nm45•ViiA™7实时荧光定量PCR系统ChannelDyeExamplesExcitationWaveLenthghEmissionWaveLenthgh1FAM™,SYBR®,SYTO®9(MeltDoctor™),Fluorescein,SYPRO®Orange455~485nm~520nm2VIC®,JOE™,TET™,HEX™510~530nm~550nm3NED™,BODIPY®TMR-X，TAMRA™540~550nm~580nm4ROX™,TexasRed®570~590nm~620nm5LIZ™630~650nm~680nm6AlexaFluor®,Joda-4650~670nm~710nmLifeTechnologiesSYBRSYBR®®GreenIGreenI染料染料染料染料染料染料染料染料46LifeTechnologiesSYBRSYBR®®GreenIGreenI作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理47LifeTechnologiesSYBRSYBR®®GreenIGreenI作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理48LifeTechnologiesSYBRSYBR®®GreenIGreenI作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理作用机理49LifeTechnologies实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化实时记录每个循环后荧光信号的变化50LifeTechnologies荧光循环数任何双链任何双链任何双链任何双链，，，，非特异结合非特异结合非特异结合非特异结合SYBRSYBR®®GreenIGreenI方法的局限性方法的局限性方法的局限性方法的局限性方法的局限性方法的局限性方法的局限性方法的局限性51不准确结果不准确结果不准确结果不准确结果非特异产物信号非特异产物信号非特异产物信号非特异产物信号LifeTechnologies通过熔解曲线检查产物特异性通过熔解曲线检查产物特异性通过熔解曲线检查产物特异性通过熔解曲线检查产物特异性通过熔解曲线检查产物特异性通过熔解曲线检查产物特异性通过熔解曲线检查产物特异性通过熔解曲线检查产物特异性•Tm值：DNA的双螺旋结构打开一半时的温度。52荧光温度LifeTechnologies单一单一单一单一单一单一单一单一PCRPCR产物的熔解曲线产物的熔解曲线产物的熔解曲线产物的熔解曲线产物的熔解曲线产物的熔解曲线产物的熔解曲线产物的熔解曲线53LifeTechnologies荧光温度多个多个多个多个多个多个多个多个PCRPCR产产产产产产产产物的熔解物的熔解物的熔解物的熔解物的熔解物的熔解物的熔解物的熔解曲线曲线曲线曲线曲线曲线曲线曲线54LifeTechnologies非特异扩增引物二聚体定量定量定量定量定量定量定量定量PCRPCR的数学原理的数学原理的数学原理的数学原理的数学原理的数学原理的数学原理的数学原理55定量定量定量定量定量定量定量定量PCRPCR的数学原理的数学原理的数学原理的数学原理的数学原理的数学原理的数学原理的数学原理LifeTechnologies线性增长期平台期PCRPCR动力学曲线和四个阶段动力学曲线和四个阶段动力学曲线和四个阶段动力学曲线和四个阶段动力学曲线和四个阶段动力学曲线和四个阶段动力学曲线和四个阶段动力学曲线和四个阶段56指数增长期对数图谱线性图谱基线期LifeTechnologies可变的平台期96次重复次重复次重复次重复指数增长期内扩增曲线具有高度重复性指数增